Y190感受态细胞，Y190酵母感受态细胞，Y190菌株
Y190感受态细胞，Y190酵母感受态细胞，Y190菌株
Y190 Chemically Competent Cell
Y190产品规格 10*100ul （货号：huayueyang1228s）
Y190产品规格 10*100ul （货号：huayueyang1228B）
Y190 Competent Cell: 100μl/支 保存： -80℃（3个月）
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存：-80℃（12个月）
Carrier DNA (5 μg/μl) 100μl 保存：-20℃（12个月）
PEG/LiAC: 5ml 保存： 4℃（12个月）
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基因型
MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, cyhr2, LYS2 : : GAL1
UAS-HIS3TATA-HIS3, MEL1 URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ
Y190感受态细胞，Y190酵母感受态细胞，Y190菌株
产品说明
Y190菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187通过mating操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为: trp1，leu2，cyh2；报告基因为： lacZ，HIS3，MEL1。Y190-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：(pGB和pACT2)或（pGBKT7和pGADT7）。质粒pGB由pGBKT7改造而来，筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒pACT2与pGADT7的结构和功能类似，筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构域：位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成 bait融合蛋白(bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD)，如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 BD和 AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y190感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
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操作方法
1. Carrier DNA 在每次使用前要通过加热处理使其变性为单链状态，步骤如下：Carrier DNA 放95℃水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min，再次放95℃水浴或金属浴3 min，快速插入冰中，静置3 min以上。
2. 取100 µl冰上融化的Y190感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒0.5-3 µg，Carrier DNA10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
3. 将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
4. 5000 rpm离心 40 s弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s弃上清。
5. ddH2O 50 µl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。
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注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 同时转化2-3种质粒时应增加质粒的用量。
4. Y190酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。
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