酵母RNA提取试剂盒
酵母RNA提取试剂盒 EASYspin
试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成 | 保存 | 50次 |
缓冲液SE | 室温 | 30 ml |
Lytic Enzyme | -20℃ | 2.5 ml |
裂解液RLT | 室温 | 20 ml |
去蛋白液RW1 | 室温 | 40 ml |
漂洗液RW | 室温 | 10 ml |
RNase-free H2O | 室温 | 10 ml |
RNase-free 吸附柱RA和收集管 | 室温 | 50套 |
本试剂盒按照指示储存12个月不影响使用效果。
储存事项：
1. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3. Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。 蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
v 产品介绍：
酵母细胞经lytic Enzyme处理去除细胞壁后,独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，然后用乙醇调节结合条件后,RNA选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
v 产品特点：
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。
v 注意事项
1. 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3. 需要自备乙醇，β-巯基乙醇，水浴锅。
4. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 关于DNA 的微量残留:
一般情况下，一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时：
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
6. RNA 纯度及浓度检测:
完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.9-2.2 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40
v 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：
ð 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中加入指定量无水乙醇!
ð 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。
ð 吸取使用量的缓冲液SE加入0.2%β-巯基乙醇备用。
1. 小量酵母培养细胞
a. 收集1ml （约107细胞）处于对数生长期酵母培养物到1.5ml离心管， 12,000 rpm离心30秒，尽可能吸弃上清。
b. 加入100μl缓冲液SE中（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.2%），轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入约20μl Lytic Enzyme储液，充分颠倒混匀，37℃温育15－30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致产量低，可以加大lytic Enzyme 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打 ，反复冻融等。
c. 加入380μl裂解液RLT（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度1%），吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13，000rpm离心3分钟,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
d. 加入280μl 96－100％乙醇，立即吹打混匀，不要离心。
e. 接操作步骤项下3。
2. 中量酵母培养细胞
a. 收集2－3ml （约3X107细胞）处于对数生长期酵母培养物到1.5ml离心管（超过1.5ml可分两次在同一个离心管内进行收集细胞），12，000rpm离心30秒，尽可能吸弃上清。
b. 加入300μl缓冲液SE中（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度0.2%），轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入50μl Lytic Enzyme储液，充分颠倒混匀，37℃温育15－30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
如果破壁效果不好导致产量低，可以加大lytic Enzyme 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打 ，反复冻融等。
c. 13,000 rpm离心1分钟，尽可能吸弃上清。
d. 加入350μl裂解液RLT（确认已经加入β-巯基乙醇至终浓度1%），吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13，000rpm离心3分钟,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。
e. 加入等体积70％乙醇（DEPC水配制，约350μl）立即吹打混匀，不要离心。
f. 接操作步骤项下3。
3. 将混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30-60秒，弃掉废液。
4. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。
5. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW,重复一遍。
6. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
7. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
8. 如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤7, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
