真菌基因组DNA快速提取试剂盒

真菌基因组DNA快速提取试剂盒

                               CAT:0440-50T

试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1.       缓冲液AP1、AP3/E低温时可能出现析出和沉淀，可以在65℃水浴几分钟帮助重新溶解（AP3加入乙醇前可加热，加入乙醇后不可加热），恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2.       避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

v  产品介绍：

该试剂盒采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统，适合于从真菌组织细胞中快速简单地提取基因组DNA。可在30分钟内完成一个或多个100mg新鲜或20mg干燥的真菌样品DNA的纯化工作。提取过程不需要用到有毒的酚氯仿等有机物抽提，也不需要用到耗时的异丙醇或乙醇沉淀，并能快速高效地去除多糖类、酚类和酶抑制物等杂质，纯化的DNA可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。

新鲜或干燥的真菌组织（细胞）磨碎后经裂解液裂解；蛋白质、多糖、细胞残片被沉淀去除；然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

v  产品特点：

1.       离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.       不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

3.       快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。

4.       数种去多糖、多酚成份和多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

v  注意事项

1.       所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.       开始实验前将需要的水浴先预热到65℃备用。

3.       缓冲液AP3/E中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.       不同来源的真菌组织细胞材料中提取DNA 的量会有差异，一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25μg。

5.       洗脱液EB不含有螯合剂EDTA， 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱， 但应该确保pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱 （10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

6.       真菌种类复杂，没有一种试剂盒可以提取所有种类的真菌DNA。如果有的真菌多糖多酚含量过于丰富、次级代谢产物太复杂导致本试剂盒效果不佳，可以选择本公司的0419-50CB型CTAB法植物DNA提取试剂盒提取真菌，一般该试剂盒对于多糖多酚次级代谢产物复杂的真菌DNA提取效果良好。

v  操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

ð 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

ð 第一次使用前请先在缓冲液AP3/E中加入指定量无水乙醇!

1.       取适量真菌组织在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。

2.       转移细粉（新鲜真菌组织100 mg 或干重组织20 mg）到一个1.5ml离心管，不要解冻，加入400μl缓冲液AP1 和4μl RNase A(10 mg/ml)，旋涡振荡，充分混匀帮助裂解。

如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。大多数情况下不需要离心去除未完全裂解的组织，因为后面有一个离心去除的步骤。

可选：多糖含量特别高的时候可以在AP1加入20ul多糖清除剂; 多酚含量特别高的时候可以在AP1中加入0.2% beta巯基乙醇。也可两者同时加入。

3.       65℃水浴10分钟，在水浴过程中颠倒离心管2-3次，混合样品。

4.       加入130 μl 缓冲液AP2，充分混匀，冰上放置5分钟， 14,000 rpm 离心5-10 分钟，小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。

5.       计算上清量，加入1.5倍体积的AP3/E（请先检查是否已加入无水乙醇!），立即吹打混匀。

加入AP3/E可能会出现絮状沉淀，但不影响DNA提取。注意将AP3/E直接加入到上清并立即吹打混匀。

6.       将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液（先加650μl离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。

7.       加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

8.       加入600μl漂洗液WB，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

9.       将吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.     取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

11.     DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在－20℃。

v  问题与解决方法