质粒DNA提取试剂盒

质粒DNA提取试剂盒

一、试剂盒组成、储存、稳定性

本试剂盒分区存放储存12个月不影响使用效果。

注意：

1.第一次使用前请现在漂洗液W2中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时标记，以免多次加入！

2.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可以在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清，使用前应该恢复到室温。

3.避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

二、试剂盒特点

    1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

    2独特的去蛋白液配方，可高效去除残留的核酸酶，即使核酸酶含量丰富的菌株如JM系列，HB101等也可以轻松去除。有效的防止了质粒被残留的核酸酶降解。

    3.快速，方便，不需要有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，获得的质粒产量高，纯度好，可直接用于酶切、转化、PCR、测序等分子生物学实验。

三、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！）

  1.所有离心步骤均在室温完成，使用转数可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

    2.溶液C和漂洗液W1含有刺激性化合物，操作是要带乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗。

  3.提取的质粒与细菌培养的浓度、质粒的拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒建议接种单菌落与1.5-4.5ml加合适抗生素的LB培养基，过夜培养12-16个小时，可提取出多达20ug的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝或大于10kb的质粒，适当加大菌体使用量，使用5-10ml过夜培养物，同时按比例增加溶液A、溶液B、溶液C的用量，其他步骤相同。

    4.洗脱缓冲液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、链接等实验。

四、自备试剂

   无水乙醇

五、操作步骤

*第一次使用前请先在漂洗液W2中加入指定量的无水乙醇！

*第一次使用前请将全部RNaseA加入到溶液A中，4℃保存！

 1.  取1-5ml过夜培养的菌液，10000rpm离心30秒，弃上清，收集菌体，尽可能的倒干上清。

（大于1ml的菌液可多次重复步骤1，直到收集到足够的菌体）

 2.  加入250ul溶液A（已加入RNaseA）,涡旋震荡彻底重悬菌体。

 3.  加入250ul溶液B，温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变清亮。

(温和的混匀，不易剧烈的震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟，以免质粒收到破坏。此时溶液因变得清亮粘稠。)

 4.  加入350ul溶液C，立即温和的上下翻转6-10次混匀，室温静止5分钟，室温12000rpm离心5分钟。

 5.  小心吸取上清加入吸附柱内（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

 5.  加入500ul漂洗液W1，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

 6.  加入500ul漂洗液W2，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

7.  重复步骤6一次。

 8. 将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，转移吸附柱到新的1.5ml离心管中，室温放置3分钟，以彻底晾干吸附柱中的残余漂洗液。

 9. 加入20-50ul洗脱液EB（洗脱液EB事先65-70℃预热洗脱效果会更好）室温放置3分钟，12000rpm离心2分钟。

注意： 1.洗脱缓冲液应不少于20ul，体积过小影响回收效率。

       2.为增加DNA的得率，可将离心得到的DNA溶液再加入核酸吸附柱中，

室温静止2分钟12000rpm离心2分钟

       3.DNA产物应保存在-20℃，以防降解。