plant RNAexr kit

◆产品编号：0416-50 ◆常温运输，保存。◆仅限于实验室使用

规格组成

   组成    50次包装    100次包装

细胞裂解液    50 mL       100ml

去蛋白液     15 mL        30ml

漂洗液       50 mL       100ml

离心吸附柱   50 套        100套

DNase I                350 μL         700μL

DNase buffer   1.5 mL × 2   1.5 mL × 4

去酶液       50 mL      100ml

洗柱液       50 mL      100ml

RNA洗脱液      10 mL       20ml

华越洋替代致癌物DEPC的外源RNA酶清除剂处理过的1.5ml无RNA酶离心管（RNA收集用）

使用方法

1. 每次微量提取一般需要50-100mg植物叶片、或50-100mg植物种子、或200-500mg植物果实。选用其中一种以下所推荐的研磨法进行组织研磨。

细胞破碎方法一：           液氮研磨法（常用方法）

将植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，用离心管估算装取50-100mg样品后加入1000ul细胞裂解液，放置于涡旋振荡器振荡30s使其充分裂解（推荐使用华越洋涡旋振荡器）。可选步骤：50℃孵育两分钟有助于组织裂解，但淀粉含量高的植物不要进行孵育。此步研磨组织的充分裂解有利于提高最后RNA得率。

细胞破碎方法二：  华越洋手持式电动组织研磨器研磨法（推荐：不使用液氮，操作方便，破碎充分）        

将50-100mg新鲜植物组织剪切成小块(保存在华越洋无液氮采样运输RNA组织样品常温保存液产品中的植物组织需用滤纸吸去RNA组织保存液后再剪切成小块)，放入2ml离心管中，加入1000uL细胞裂解液，然后用华越洋电动组织研磨器研磨5-20秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。

2. 将上步所得混合物中的液体成分移至干净的1.5ml离心管（可不必转移非液体的细胞碎片）。注意：有的植物组织（比如果实）含有大量水份，研磨混合物液体成分会多于1mL，转移时也只取1mL。

3. 在离心管中加入300μL的去蛋白液（请取下层溶液）和200μL自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。可选步骤：震荡后室温放置两分钟。

4. 室温12000 g离心5-10分钟，两相间将有约5-10mm厚的细胞破碎物。将上清液(不超过700μL)转移到另一干净的1.5mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100μL上清液不取。

5. 加入等体积的漂洗液，充分颠倒混匀（此时如有沉淀产生，属于正常现象，不能丢弃沉淀，务必将沉淀混合物一起上柱）。再将所得混合物分两次(每次体积不超过700ul)加入同一个离心吸附柱中，每次加入吸附柱后都12000g室温离心1分钟，弃穿透液。

6. 向吸附柱加500μL洗柱液，12000g室温离心1分钟，弃穿透液。再向吸附柱加入500μL洗柱液，重复一遍。然后再室温12000g离心1分钟以便去除残留的液体（此步非常重要否则残留的液体会影响后续实验）。

7. 膜上消化DNA（此步省略：选用非DNA酶配套的RNA提取试剂盒或后续反转录实验选用了华越洋去DNA污染的反转录试剂盒客户）。一般任何RNA提取试剂盒都不可避免出现DNA的微量残留。而大多数RT-PCR扩增中极其微量的DNA残留（核酸电泳检测不到）对实验影响不大。如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物选择时：选用跨内含子的引物，以穿过mRNA的链接区，这样DNA残留就不能作为模板参与扩增反应。

7.1  将5μL的RNase-free DNase I加入到45μL DNase buffer中混匀（务必在离心管中混匀）配成DNA消化液，预热消化液37℃，1分钟,加入到离心吸附柱中（一定是柱中央即吸附柱膜中央）室温（20-30℃）放置5分钟。如果加入未预热的DNA消化液，室温放置时间为10-15分钟。如果出现DNA微量残留，某些样品DNA含量较高或存在抑制DNA酶活性的杂质，这时可以加大DNA酶的用量和室温放置的时间。

7.2  直接在离心吸附柱中加500uL的去酶液，盖上盖后颠倒混匀数次。

7.3  室温12000 g离心1分钟，弃穿透液。

7.4  再加500uL的去酶液，12000 g室温离心1分钟，弃穿透液。

7.5  室温12000 g离心2分钟，此步非常重要，否则残留的液体会影响RNA的使用。

8. 将离心吸附柱转移到RNase -free1.5ml离心收集管中，加入30-80μLRNA洗脱液，室温放置3-5分钟。12000 g室温离心1分钟，离心管中溶液即为RNA样品。（注意：洗脱体积不应小于30ul，否则影响RNA的充分洗脱，影响RNA产量。如果要提高产量可以另外加入30ul的RNA洗脱液重新洗脱，合并两次洗脱液；如果要提高所得溶液RNA浓度可将所得RNA溶液重新上柱再次洗脱）

注意：所得RNA溶液可以立即使用或存放于-80℃待用。