酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒

酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒

v  试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1.      第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1（终浓度100µg/ml）置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNase A即可。

2.      环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

3.      Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。 蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。

4.       避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

v  产品介绍：

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合lytic Enzyme特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后，加入破壁酶去除细胞壁后，然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除， 最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

v  关于平衡液的使用

1.       介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。

2.       使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

v  注意事项

1.       所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.       溶液YP3和去蛋白液PE中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

3.       通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或者分光光度计都很难检测到。提取的质粒如果用于下游试验时通常建议使用量为： 1-5μl用做PCR 模板;5-10μl 用于转化大肠杆菌,选择商业化的高效率的感受态细胞。

4.       用户需要自备Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na₂EDTA，28 mMβ-巯基乙醇)。配制方法：在600 ml 去离子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na₂EDTA (pH 8.0) ，不需要调节PH值，定容到1L，4℃保存。临用前加0.2%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。

5.       菌体浓度检测一般OD₆₀₀值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x10⁷ cells/ml，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。

6.       洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

v  操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

ð 第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

ð 将RNase A全部加入溶液YP1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

ð 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.2%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

1.       取1.5-5毫升酵母培养物(不超过5X10⁷ cells)，9,000rpm离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

收集超过1.5毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。

2.       加入300μl Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；再加入50μl Lytic Enzyme储液，充分颠倒混匀，37℃温育1-3小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大lytic Enzyme 用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打 ，反复冻融等。玻璃珠法：向菌体中加入250μl溶液YP1(请先检查是否已加入RNase A)重悬沉淀，彻底悬浮菌体，加入0.1g直径为0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠，涡旋振荡10分钟，静置几分钟让玻璃珠沉淀，小心吸取上清到一个新管后接后续步骤4。

3.       13,000rpm离心1分钟，尽可能吸弃上清，加入250μl溶液YP1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。  

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4.       加250μl的溶液YP2，温和地上下翻转4 -7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。

温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。

5.       加350μl溶液YP3，立即温和地上下翻转4 -7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟，小心取上清。

加入溶液YP3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。

平衡液预处理吸附柱：

使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用”

6.       将上一步所得上清加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中）， 12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。

7.       加入500μl去蛋白液PE（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30-60秒，弃废液。

8.       加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30-60秒，弃掉废液。

9.       加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30-60秒，弃掉废液。

10.     将吸附柱EC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11.     取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，13,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。