Trizone总RNA提取试剂
Trizone Reagent
一、Trizone总RNA提取试剂组成、储存、稳定性
试剂盒组成 | 保存 | 100ml |
Trizone | 4℃ | 100mL |
说明书 | 1份 |
本试剂盒4℃避光储存12个月不影响使用效果。
Trizone总RNA提取试剂产品简介：
Trizone是光谱型总RNA提取试剂。实验操作快速方便，颜色鲜明，便于分层。本试剂适用范围广泛，可以从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等样品中提取总RNA。样品在Trizone中被充分裂解的同时能够最大限度的保证RNA的完整性，在加入氯仿离心后，溶液会分成3层：上层无色水相、中间层和下层粉红色有机相，RNA分布在上清层中。收集上清层后，经过异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA，提取的总RNA完整性好，无蛋白和DNA污染，可以用于各种分子生物学常规实验，如RT-PCR、Real-timeRT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等。
Trizone总RNA提取试剂
二、实验前准备及重要注意事项
1.预防RNase污染，应注意以下几个方面：
a.使用无RNase的塑料制品和吸头，避免交叉污染。
b.玻璃器皿应在使用前于180℃高温下烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
c.配制溶液应使用无RNase的水。
d.实验操作人员需戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2.提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的了和质量。
3.本品含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼烧以及其他身体伤害，使用本品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到皮肤和眼睛，应立即用大量清水冲洗并前往医院治疗。
4.样品用Trizone匀浆后，如不即可加入氯仿，置于-70℃下可放置一个月以上。
5.保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8℃可以保存一周，-20℃条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成cDNA，Northern BIot等。
6.若下游实验对DNA非常敏感，建议用不含RNase的DNaseI对RNA进行处理。
三、自备试剂
氯仿、异丙醇、75%乙醇、无RNase的水（新开封或提取RNA专用）
四、操作步骤
1.各种材料的处理
a.植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在Trizone中迅速研磨，每30-50mg组织加入1ml Trizone,混匀
注意：样品体积一般不要超过Trizone体积的10%。
b.动物组织：取新鲜或-70℃冻存的动物组织尽量剪碎，每30-50mg组织加入1ml Trizone，匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入Trizone 1ml混匀。
注意：样品体积一般不要超过Trizone体积的10%。
c.单层培养细胞：吸取培养液，可直接在培养板中加入适量Trizone（每250px²面积需要1ml Trizone），用取样器反复吹打使细胞裂解。也可以用胰蛋白酶处理后，将细溶液溶液转移至RNase-Free的离心管中，300g离心5min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清，加入1ml Trizone混匀。
注意：1）收集细胞数量不要超过1-107。
2）Trizone加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果Trizone加量不足，可能导致提取RNA中有DNA污染。
3）收集细胞时一定要将细胞的培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA产量降低。
d.细胞悬液：离心收集细胞。每5-106-1-107动物、植物和酵母细胞或每-107细菌细胞加入1ml Trizone
注意：1）加入Trizone前不要洗涤细胞，以免RNA降解。
2）一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪或液氮研磨处理。
e.血液处理：直接取新鲜血液，加入3倍体积Trizone（推荐0.25ml全血加入0.75mlTrizone），充分震荡混匀。
f.可选步骤：对于蛋白、脂肪、多糖或胞外物质含量高的样品，如肌肉组织、脂肪组织或植物块茎，可以在匀浆处理后4℃，12000rpm离心10分钟以去除不容物质，此时沉淀中含胞外物质、多糖和高分子量的DNA，而RNA存在于上清中。
2. 样品中加入Trizone后反复吹打几次，使样品充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
3. 向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml Trizone加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置2-3分钟。
4. 4℃12000rpm离心15分钟，此时样品分成三层，粉红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA在水相中，把水相（约600ul）转移到一个新的RNase-Free离心管（制备）中。
5. 得到的水相溶液加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。
6. 4℃12000rpm离心10分钟，弃上清。
7. 加入75%乙醇（用无RNase的水配制）震荡混匀，洗涤沉淀。每使用1mlTrizone用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤。
8. 4℃ 12000rpm离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要洗弃RNA沉淀。
注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀
9. 室温放置2-3分钟，晾干。加入30-100ul无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存到-70℃，防止降解。
注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解
Trizone总RNA提取试剂
