Trizol搭档

TRIzol搭档

TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。 但其缺点之一是没有柱式升级产品，客户任然要使用既繁琐又费事的非柱式操作，另一缺点是不能用于富含多糖和多酚的材料。为解决此问题，华越洋特别推出此产品：TRIzol搭档！

TRIzol搭档的特点：

1. 跟TRIzol结合使用，把经典操作变成了柱式操作，简化了实验流程，用户可以节约30分钟的时间。

2. RNA质量更好，因为操作简短减少了RNA在提取过程中的降解。

3. RNA纯度更高，OD260/OD280一般在1.9以上，比经典TRIzol法得到的更纯。

4. 专门的洗涤条件能有效去除基因组DNA，进一步减少其对RNA的污染

5. 适用于其他基于酸酚/异硫氰酸胍提取原理的RNA提取产品,包括TRIzol、TRIzol LS、TRI Reagent等。

6. 可以省略氯仿处理步骤，避免接触有毒试剂（但效果稍差）。

TRIzol搭档的使用方法：

1.按 TRIzol的使用手册进行总 RNAs提取到加氯仿之前一步。

2.如果需要加氯仿，则继续按 TRIzol的使用手册操作，用氯仿处理裂解液离心后得到上清液。如果省略氯仿处理步骤，则需要将裂解物直接离心。

3.将经过氯仿处理得到的上清液或没有经过氯仿处理直接离心得到的裂解液转移至一个干净的 1.5 mL塑料离心管中。注意：如果是经过氯仿处理，则离心后，下层有机相和中间层将含有 DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和 DNA污染。为保险起见，可以留下 100 uL上清液不取。同时吸取上清时最好缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。

4.加入等体积的溶液A，颠倒混匀 30秒。

5.根据混合物的多少，一次或分两次转移到离心吸附柱中。

6. 每次转移后，需要13000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透

液。

7. 加 0.7 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的

穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品OD260/280 比值不

高，可以再用0.3 mL 通用洗柱液重复此步一次。

8. 室温离心半分钟。此步对去除残留通用洗柱液十分重要，否则残留的通用

洗柱液会影响RNA 的质量和使用。

9. 将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 收集管中，加入50-100 uL

RNA 洗脱液。

10. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于

-80℃待用。

11. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern 杂交，强烈建议用户使

用甲醛变性胶进行RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子

（BioTechniques，28：414，2000）。

12. RNA 产量产率测定：将5-10 μL RNA 溶于TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之

间)检测其在OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出RNA 浓度（1 OD260

的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA 的产量（浓度X 体积)和产率(RNA

产量/组织用量)。

13. RNA 纯度测定：无污染的总RNA 的OD260/OD280 一般在1.8-2.1 之

间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分

别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR 等反应。

Q：上样孔里的红色荧光物一定是DNA 污染吗？

A：不是。用TAE 或TBE 电泳液和非变性胶电泳RNA 时容易产生此现象，天

泽基因初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA 通过碱基

互补或通过硼酸络合（如果使用TBE 作电泳液的话）形成的复合物，加

RNase 处理后，这些红色荧光物(RNA)一般会消失。为避免此现象，建议

最好使用甲醛变性胶电泳和RNA 专用上样液(如华越洋基因的RNAon)。

Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？

A：如果怀疑有DNA 污染，可以用RNase 处理RNA 样品，然后再电泳。如

果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA 污染。进一步确认

可以使用PCR 扩增法。去除污染的DNA 可以使用华越洋基因的非酶的DNA

去除剂DNA Erasol 或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase 一

般都有残留的RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的手册进行操作。