动物组织/细胞RNA提取试剂盒
动物组织/细胞RNA提取试剂盒
| 产品货号 | 产品名称 |
北京华越洋生物GT2654 | 动物组织/细胞RNA提取试剂盒 |
动物组织/细胞RNA提取试剂盒产品简介：
本试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合，可从动物细胞及组织中高效提取总RNA。起始样本一般最多30 mg组织或1×107细胞。本试剂盒还可回收未完全纯化的RNA、体外转录和酶促反应后得到的RNA。用本试剂盒可提取纯化分子量大于200碱基的高品质RNA，几乎无DNA残留。如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于RT-PCR、Nothern Blot、Dot Blot等下游实验。
动物组织/细胞RNA提取试剂盒产品构成：
Component | 50 preps | |
DNase I | 1000 U | |
10×Reaction Buffer | 1000 μl | |
Buffer RL | 35 ml | |
Buffer RW1 | 30 ml | |
Buffer RW2（concentrate） | 11 ml | |
RNase-Free Water | 10 ml | |
Spin Columns RMwith Collection Tubes | 50 | |
RNase-Free Centrifuge Tubes1.5 ml | 50 |
自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）。
动物组织/细胞RNA提取试剂盒实验前准备及重要注意事项：
1．预防RNase污染，应注意以下几方面：
1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
3）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2．提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。
3．Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，1ml Buffer RL加10μl β-巯基乙醇。加入β-巯
基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。
4．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
5．Buffer RL如果产生沉淀，可于56℃加热使其溶解后室温放置。
6．所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。
动物组织/细胞RNA提取试剂盒操作步骤：
1． 样品处理
1.1组织：将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600 μl Buffer RL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇），组织样本少于20 mg加350 μl Buffer RL。样品体积不超过Buffer RL体积的1/10。
1.2单层培养细胞：将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液，离心得到细胞沉淀，弃上清，每6-10 cm2培养面积加入600 μl Buffer RL，小于6 cm2加入350 μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。
1.3 细胞悬液：12,000 rpm（～13,400×g）离心1分钟弃上清，得到细胞沉淀。每5×106-1×107细胞加入600 μl Buffer RL，少于5×106细胞加入350 μl Buffer RL，反复吹打几次，使其充分裂解。注意：
1）尽量除尽细胞培养基，细胞培养基可能抑制细胞的裂解影响RNA产量。
2）尽量使细胞充分悬浮并充分裂解，否则影响RNA产量。
2．样品充分裂解后，室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
3．12,000 rpm离心2-5分钟，取上清进行以下操作。
4．向步骤3中得到的溶液中加入1倍体积（600 μl或350 μl）的70%乙醇（无RNase水配
制），混匀。
注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，不会影响后续实验。
5．将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns RM）中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入，12,000 rpm离心1分钟，弃废液。将吸附柱放回收集管中。
注意：吸附柱的最大载量为100 µg，不要超载，否则会影响RNA的产量和纯度。
6．向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7．配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×ReactionBuffer和20 μl DNase I（1 U/μl），混匀， 配制成终体积为80 μl的反应液。
8．向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液，20-30℃孵育15分钟。
9．向吸附柱中加入200 μl Buffer RW1，12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10.向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
11.重复步骤10。
12.12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。
13.将吸附柱转入新的离心管中，向吸附膜中间位置加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：
1）RNase-Free Wate体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。
2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤13。
3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。
