Y1HGold酵母感受态细胞

            Y1HGold酵母感受态细胞

Y1HGold Chemically Competent Cell 产品说明书

产品规格

Y1HGold：                    10×100μl            保存条件：-80℃

pAbAi（control vector）：10ng/μl      10μl            保存条件：  4℃

Carrier DNA：          5ug/μl    100 μl            保存条件： -20℃

PEG/LiAc：                        5 ml            保存条件：  4℃

基因型

MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL1

产品说明

Y1HGold菌株是Clontech公司开发的GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。Transformation marker为: ura3，leu2；报告基因为：AbAr。

Y1HGold -GAL4-AbA酵母单杂系统需要两种质粒配套使用：pAbAi和PGADT7。质粒pAbAi的筛选标志为URA，用于表达 pBait-AbAi construct (1~3个bait DNA序列重复串联后克隆到pAbAi中)；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4-AbA酵母单杂系统原理：Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度(0.1-0.2ug/ml) 下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了pBait-AbAi 的酵母菌株（Bait-Reporter Yeast Strains），当猎物蛋白（Prey）结合到诱饵序列（Bait DNA）上，GAL4 AD就会激活AbAr 的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长。AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。High5TM系列Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经pAbAi质粒检测转化效率>103cfu/μg DNA 。

Y1HGold酵母感受态细胞操作方法

1. 取pBait-AbAi质粒5ug，BstBI 或 BbsI酶切1小时，回收。

2. 取100 μl冰上融化的Y1HGold感受态细胞，依次加入预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5ug（体积不高于15ul），Carrier DNA（95-100度5min,快速冰浴，重复一次）10 ul ，PEG/LiAc  500ul并吸打几次混匀，30度水浴30 分钟（15 min时翻转6-8次混匀）。

3. 将管放42度水浴15min  （7.5 min时翻转6-8次混匀）。  

4. 5000 rpm 离心 40s 弃上清，ddH2O 400ul 重悬，离心 30s 弃上清。                      

5. ddH2O 50ul重悬，涂SD/-Ura平板,29℃培养72h。

6. 挑取5-10个克隆，用PCR方法确定pBait-AbAi整合到Y1HGold基因组中，PCR阳性菌株在SD/-Ura平板划线，29℃培养72h，4℃保存，此菌株即是Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。

 Y1HGold酵母感受态细胞

Preparation of Media：

YPDA （1L）:

 Tryptone               20g

 yeast extract            10g 

 0.2% adenine           15ml

 补水到 950ml，  用盐酸调PH到6.5

 Agar                20g (for plates only)

 121度，15分钟高压灭菌，

 待培养基温度降到55度时，加

 入已过滤的40% 葡萄糖 50 ml

0.2% adenine(1L)

 Adenine    2g

 补水   到1L

 溶解后高压灭菌

 或0.22um 滤膜过滤除菌

 Y1HGold酵母感受态细胞

注意事项

1. 感受态细胞最好在冰上融化。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4. Y1HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。

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