DB3.1感受态细胞

DB3.1感受态细胞

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储存条件：-70 ℃ 保存，避免反复冻融
 产品介绍：华越洋生产的大肠杆菌DB3.1细胞含有gyrA462基因，对λ嗜菌体的ccdB基因产物的毒性具有抵抗作用，特别适用于转化和扩增包含ccdB基因的质粒载体。使用pUC19 质粒检测，转化效率可达107 cfu/μg DNA.，－70 ℃ 保存几个月转化效率不发生改变。每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。质量稳定，使用方便，质优价廉。

DB3.13菌株的基因型为：F- gyrA462 endA1 Δ(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) supE44ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(SmR) xyl-5 λ- leu mtl1
 抗生素耐药性：DB3.13感受态细胞具有链霉素抗性。
 操作步骤（以下操作均按无菌条件的标准进行）：提示DB3.1 感受态细胞应保存在－70℃ ，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
（1）取DB3.1感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。一次转化DB3.1感受态细胞的建议用量为 50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl DB3.1感受态细胞为例。
（2） 向DB3.1感受态细胞悬液中加入目的 DNA ( 100μl 的感受态细胞能够被1ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30 分钟。
（3） 将离心管置于 42 ℃ 水浴中放置 90 秒，然后快速将管转移到冰浴中，使DB3.1细胞冷却 2 分钟，该过程不要摇动离心管。此步骤也可将离心管置于室温进行，时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置5-8 分钟左右；如果室温较低，可延长时间至8-15 分钟左右。条件允许建议使用 42 ℃ 热激方法。
（4）向每个离心管中加入500μl无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37 ℃ 150rpm，摇床振荡培养45 分钟，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
（5）无菌条件下，取适量菌液加到含相应抗生素的LB 固体培养基平板上，用无菌的细菌涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养12-16 小时。 涂布用量可根据具体实验来调整。转化质粒在10ng 左右，90mm 平皿涂布100μl，55mm 平皿涂布50μl；连接产物的转化菌液建议离心后倒掉大部分上清，余200μl，取100μl 用于涂布。
（6）保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留。

DB3.1感受态细胞相关试剂及培养基的制备方法
（1）LB 液体培养基：称取10 g,Tryptone，5 g Yeast Extract 和10 g NaCl 置于1 L 烧杯中。加入约800 ml 的去离子水，完全溶解后用2mol/L 的NaOH 溶液调节pH 值至7.0。加去离子水定容至1 L。分装后，121℃高压灭菌20 分钟。
（2）SOB 和SOC 培养基：称取20g Tryptone ，5g Yeast Extract ，0.5g NaCl 置于1L 烧杯中加入约800ml 的去离子水，完全溶解后再补加10ml 250 mM KCl 溶液，滴加5M NaOH（约0.2ml）调pH 值7.0。 加入去
离子水将培养基定容至1L。121 灭菌20min。使用时加入5ml 灭菌的2M MgCl2 溶液（此种培养基称为
SOB）。再补加经0.22um 过滤除菌的1M 葡萄糖溶液2ml（此种培养基为SOC）。
（3） 转化复苏细菌用的液体 LB 培养基或SOC 培养基：可以一次高压50ml 液体培养基，无菌状态按1ml 每管分装于高压灭菌的1.5ml 离心管中，装于自封袋中，冻存于-20℃中，每次用一支。可以极大地避免培养
基污染和减少劳动量。
（4） LB 固体选择培养基：100ml LB 液体培养基中加入1.5 g 琼脂粉，摇匀后，121℃高压灭菌20 分钟。冷却至50℃左右时加入相应浓度的抗生素（如AMP 浓度通常为100ug/ml），混匀后倒在细菌用的无菌培养皿中，等琼脂凝固后即可使用。
（5）IPTG：称量1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于40 ml 灭菌水，浓度为200mmol/L。用无菌0.22 μm过滤膜过滤除菌。小份分装后，-20℃保存。
（6） X-gal：用DMF（二甲基甲酰胺）配制成20 mg/ml，小份分装（1 ml/份）后，-20℃避光保存。

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