Stable 电击/电转感受态细胞

Stable 电击/电转感受态细胞

Stable Electroporation Competent Cell

Stable电击/电转感受态细胞基因型：

F' proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRMS -mcrBC)

Stable电击/电转感受态细胞说明：

Stable电击/电转感受态细胞只能用于电击转化，不可用于热激转化。Stable菌株是NEB公司开发的高转化效率菌株，是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株，具有与Stbl2，Stbl3完全不同的基因型，但是表现出比Stbl2，Stbl3更优异的性能，特别适合慢病毒或具有末端重复序列DNA片段的克隆。基因组含有重组酶recA1 rel A1突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率；同时含有核酸酶endA1突变，避免了提取质粒过程中核酸酶的污染，大大提高了高纯度病毒质粒的产量和质量。lacZΔM15的存在使Stable可用于蓝、白斑筛选，此菌株具有四环素和链霉素抗性。

Stable电击/电转感受态细胞操作方法：

1. 2.5px 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的Stable电击/电转感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；

B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA浓度不超过100ng/μl，体积不超过5μl/50μl 感受态。

3. 用200 μl枪头将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

5. 2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基（室温），用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml离心管（BD Falcon50ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至5ml。30℃，225 rpm复苏90分钟。当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率，则需37℃，225 rpm复苏60分钟

6. 5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径375px培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养20-24小时。

Stable电击/电转感受态细胞注意事项：

1.   对不稳定DNA片段的克隆或逆转录病毒/慢病毒载体的构建，涂板后平板应在30℃培养，以减少发生错误重组的概率。

2.   制备高纯度病毒质粒时，应使用新鲜转化的平板接菌，新鲜菌液提取质粒，菌液不可低温保存后提取质粒。

3.   感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中10分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。混入目的DNA时应轻柔操作。

4.   加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

5.   电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

6.   当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

7.   电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

8.   若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

9.   对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

10.  混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

11.  电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

Stable电击/电转感受态细胞优点及应用

1. Stable菌株与Stbl3相比，基因组含有endA 突变，提高了病毒质粒的产量和纯度。

2. Stable菌株比Stbl3生长速度快，倍增时间是Stbl3的1.5倍。

3. Stable菌株基因组中含有fhuA突变，赋予其对噬菌体T1的抗性。

4. Stable菌株具有较高的转化效率，pUC19检测转化效率>5×108 cfu/μg DNA。

5. Stable菌株基因组中含有lacZΔM15，可用于蓝白斑筛选实验。

6. Stable菌株特别适合于不稳定DNA片段的克隆，及逆转录病毒/慢病毒载体的构建和扩繁。

Stable电击/电转感受态细胞保存条件： -80℃

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