GV3101电击/电转感受态细胞

GV3101电击/电转感受态细胞

GV3101 Electroporation Competent Cell

GV3101电击/电转感受态细胞基因型：

C58 (rif^r) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent^r) Nopaline

GV3101电击/电转感受态细胞说明：

GV3101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。唯地生物开发的GV3101电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒 (size:11633 bp)检测转化效率>10⁵ cfu/ µg DNA；经pCAMBIA2301-ZH质粒 (size:40 kd)检测转化效率可达5×10³ cfu/ µg DNA。

GV3101电击/电转感受态细胞操作方法：

1.   0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2.   取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1-5µg质粒DNA（质粒体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

3.   启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。

4.   6000 rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50 µg /ml kan 时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50 µg /ml kan，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60 h；如果使用的平板含有50µg /ml rif 则需要28℃培养72-90 h）。

 GV3101电击/电转感受态细胞注意事项：

1.   加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2.   混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.   平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。

4.   利福平浓度不应高于25µg /ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50µg /ml kan，若所用平板含有20µg /ml rif则转化效率降低到1/2。

5.   培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。

GV3101电击/电转感受态细胞保存条件： -80℃

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