EPI400电击/电转感受态细胞

EPI400电击/电转感受态细胞

EPI400 Electroporation Competent Cell

EPI400电击/电转感受态细胞基因型：

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL (StrR) nupG trfA tonA pcnB4 dhfr

EPI400电击/电转感受态细胞说明：

EPI400电击/电转感受态细胞只能用于电击转化，不能用于热激转化。该菌株来源于EC100菌株，将EC100核基因中控制质粒拷贝数的pcnB基因删除后引入一个诱导启动子驱动的pcnB基因，即是EPI400菌株。EPI400菌株可以降低质粒的拷贝数，特别适合于各种不稳定DNA或毒性基因的克隆，在加入诱导剂CopyCutter Induction Solution后又可以提高质粒产量到正常状态。[mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)]基因型使EPI400菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。lacZΔM15标记的存在使DH10B可用于蓝白斑筛选，tonA赋予其抗噬菌体T1和T5的能力，rpsL赋予其链霉素抗性。EPI400电击/电转感受态细胞适用于不稳定DNA或毒性基因的克隆，经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>10¹⁰ cfu/μg DNA。

EPI400电击/电转感受态细胞操作方法：

1. 2.5px 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的EPI400电击/电转感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；

B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA浓度不超过100ng/μl，体积不超过5μl/50μl感受态。

3. 用200 μl枪头将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

5. 2min后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl不含抗生素的无菌SOC培养基（室温），用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml离心管（BD Falcon50ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至5ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。

6. 5000rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径375px培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。

EPI400电击/电转感受态细胞注意事项：

1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

5. 对于连接产物转化，最好转化前乙醇沉淀DNA后用适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物，保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

6. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

7. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。

EPI400电击/电转感受态细胞保存条件： -80℃

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