高保真PCR扩增试剂盒
高保真PCR扩增试剂盒
高保真PCRmix kit
编号 |
名称 |
品牌 |
规格 |
当日秒杀价 |
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0418-100 |
高保真PCRmix kit |
Waryong |
100次 |
240.00 |
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0518-500 |
高保真PCRmix kit |
Waryong |
500次 |
790.00 |
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产品组成、储存:
组成 100次 500次
Pfu(5 U/μl) 50μl 250μl
10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) 1 ml 3ml
dNTP(10mM each) 100μl 0.5 ml
PCR 灭菌水 5 ml 25 ml
储存:-20 ℃
v 产品介绍:
本试剂盒提供DNA高保真扩增所需要的基本试剂。DNA扩增时,用户需要自行准备模板和扩增所需要的引物。高温嗜热Pfu DNA聚合酶主要用于对保真度要求非常高的DNA扩增,这些扩增要求扩增的产物中不能出现突变等错误。Taq DNA聚合酶的扩增性能很强,但是用Taq扩增的PCR产物中有难以避免的随机突变。Pfu DNA聚合酶除了5′-3′的聚合特性外,还有3′-5′端外切酶活性, 具有校正DNA扩增过程中突变。Pfu DNA的长片段扩增的能力不及Taq DNA聚合酶,客户如果用于长链PCR扩增,可选用本公司的Long Taq或者Taq Plus DNA 聚合酶。
v 举例说明:
按下列组份配制PCR反应液
Pfu(5 U/μl) |
0.5 μl |
10×Pfu PCR Buffer(Mg2+ Plus) |
5 μl |
dNTP Mixture(10 mM each) |
1 μl |
模板DNA(质粒5-20ng,基因组100-500 ng ) |
?ul |
引物 1(20 μM) |
1 μl |
引物 2(20 μM) |
1 μl |
灭菌蒸馏水 |
up to 50 μl |
混匀后,按下表的条件立即进行PCR
循环次数 |
反应阶段 |
温度 |
时间 |
1 |
变性 |
92-94°C |
2 分钟 |
20-35 |
变性 退火 延伸 |
92-94°C 55°C 72°C |
30秒 45秒 2分钟/kb |
1 |
延伸 |
72°C |
7分钟 |
v 注意事项:
1. Pfu扩增效率通常比Taq酶差,这是由于Pfu具有3′-5′的外切酶活性(高保真性)所引起的,不是由于Pfu酶的质量不稳定所致。Pfu扩增1.5kb以下的DNA片段和Taq没有多大差别。
2. 10×Pfu PCR Buffer中已含有Mg2+,用该缓冲能保证扩增产物的保真性。提高反应体系的pH和Mg2+浓度能部分提高DNA扩增的产率,但产物的保真性将有所下降。
3. 用Pfu扩增时,引物的纯度要求较高,长度要求大于18bp,Tm在55-80℃之间。引物的浓度在0.1-0.5μM之间,比Taq略高。Pfu具有3′-5′的外切酶活性可能会降解引物,特别是溶液中没有dNTP的情况下。所以,Pfu必须是最后加入到反应体系中,并立即进行PCR反应。
4. Pfu的热稳定性比Taq酶高,对于GC含量很高的模板,变性温度可以提高到98℃,而不会影响Pfu的活性。
5. PCR产物为平端,不能直接用T/A克隆方式克隆。需要加A后才能进行克隆。
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