明胶酶谱法试剂盒

明胶酶谱法试剂盒

Matrix Metalloproteinases Zymography Electrophoresis Kit

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解 细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组 织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的 MMP-2、MMP-9 参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视 。

明胶酶谱法被广泛地用于明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)的测定，由于有活性的酶和无活性的酶原存在分子量的差别，明胶酶谱法可有效分离有活性的酶和无活性的酶原。而且能分离紧密结合在具有活性的酶上的内源性组织抑制剂(TIMPs)。在此基础上发展了反明胶酶谱法和原位明胶酶谱法等，分别用于测定明胶酶的抑制剂和细胞与组织中明胶酶的定位。

本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测 MMP-2、MMP-9  活性。Zymography  是一种广为使用的、基 于 SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达 1 nM，高于 ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的 SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电 泳， 电泳结束后取出凝胶与酶反应 Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深 染，形 成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色 而形成透 亮区域，从而能同时指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。

本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶谱及活性，检 测灵敏度~1 nM。试剂盒可进行 50 次标准小胶检测，如果小胶加样孔为 10~15个，则总计可检测 500~750 个样品。

适用: 

检测 MMP-2、MMP-9 酶谱及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）。 

组成与储存 (50 assays)：

     1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, -20 ℃；

2. 10 × Substrate G, 50 ml, -20 ℃；

3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ℃, 使用时用蒸馏水稀释；

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ℃, 使用时用蒸馏水稀释；

5. SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液, 4 ℃。

检测步骤：

1. 制备含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝胶：推荐分离胶浓度为 8%。按照标准程序制备 SDS- PAGE 凝胶。将 10 × substrate G 融化，并 90 ℃加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加 入 10 × substrate G 并使之稀释 10 倍，混匀后加入过硫酸铵和 TEMED，等待凝胶聚合。

2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染  Marker即可。阳 性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血与 100µl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合，取 5-15µl 上样。

3. 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为 20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4. 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。

5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或 37℃孵育 1~5 小时。阳性 对 照或者血中的 MMP 通常 37℃ 孵育 1 小时即可显示。如 MMP 活性低，应延长孵育时间为 10 小时或 过一夜。

6.  显色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见 SDS-PAGE 凝 胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有 MMP 条带的位置 不被染 色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及 活性。阳 性对照将在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出现透 明条带。

7. 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 MMP 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP  条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中最常见的格式。

说明：

1. 10 mM EDTA 能够完全抑制 MMP 活性。

2. 凝胶干燥：可使用聚丙烯酰胺凝胶干胶装置(#P2000)室温快速干燥凝胶，作为永久记录保留。