酵母钾离子转运活性检测试剂盒

酵母钾离子转运活性检测试剂盒

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产品组成：

酵母钾离子转运活性检测试剂盒产品介绍： 

R5421 酿酒酵母菌株为 K⁺/钾离子缺陷型菌株，其内源的两个钾离子转运基因(TRK1,2)被突变，在文献中也称为 CY162，多用于 K⁺/钾离子转运蛋白的鉴定试验中，也可用于 K⁺/钾离子通道或钠钾离子泵的鉴定[1-2]。Transformation marker 为：Ura3，Leu2。该菌株可以在含有 100 mM KCl 的培养基中正常生长，在含有 5-10 mM KCl 的培养基中生长缓慢，当培养基中 KCl 浓度低于 0.5 mM，R5421 细胞停止生长[3-4].

pYES2 是酿酒酵母蛋白高效表达载体，筛选标记为 Ura3。GAL1 启动子，需要利用半乳糖诱导蛋白表达。将 K⁺转运蛋白基因 X 构建到 pYES2 载体中(pYES2-X)，将其转化 R5421 感受态细胞，X 蛋白就会介导酵母从培养基中吸收钾离子，进而使得 R5421 酵母菌能够在低钾 AP 培养基中正常生长。

酵母钾离子转运活性检测试剂盒产品特点： 

本试剂盒可用于检测蛋白是否具有钾离子转运活性，简单高效。包含了钾离子转运活性检测所需的全部试剂、菌株和载体。

注意事项： 

1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗、食品及化妆品等用途。

2. 为了您的安全的健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3. 请注意无菌操作，避免微生物污染。

4. 此方案仅供参考。

酵母钾离子转运活性检测试剂盒操作步骤： 

一、培养基准备 

SD/-Ura with Agar (含 100 mM KCl)固体培养基：将 1 条培养基溶于 0.5 L 去离子水中，无需调节 pH 值，高温高压灭菌(如 115℃灭菌 20 min)，按照 20-25 mL/块倒平板(90 mm)，凝固后 4℃冰箱保存。

SD/-Ura Broth (含 100 mM KCl)液体培养基：将 1 条培养基溶于 0.5 L 去离子水中，无需调节 pH 值，高温高压灭菌(如 115℃灭菌 20 min)，4℃保存备用。

不同 KCl 浓度的 APG/-Ura 固体培养基：按表 1 分别加入各组分，配置 100 mL 含不同 KCl 浓度的 APG/-Ura 固体培养基。高温高压灭菌(如 115℃灭菌 20 min)，20-25 mL/块倒平板(90 mm)，4℃冰箱保存。

二、菌株使用与保存

2.1 冻干粉溶解（可选择将冻存管中冻干粉全部溶解或部分溶解）

1. 全部溶解

取一整管冻干粉，加入 200 μL 无菌水或无菌培养基溶解，重悬后即可得 200 μL 菌悬液，直接用于菌株活化，剩余菌液-80℃冰箱保存（建议分装保存，注意避免反复冻融）。

2. 部分溶解

用枪头刮取管中冻干粉，用无菌水或无菌培养基溶解，直接用于菌株活化，剩余冻干粉-80℃保存。

2.2 菌株活化

取 2.1 中冻干粉溶解得到的菌液(10-50 μL)于 SD/-Ura with Agar (含 100 mM KCl)平板上划线，28-30℃培养3-5 d，培养出来的单菌落可直接用于钾离子转运活性检测实验。

2.3 菌株保存

挑取上述单菌落于 SD/-Ura Broth (含 100 mM KCl)液体培养基中，200 r/min，28-30℃振荡过夜培养，OD600应大于 1，取 1 mL 菌液集菌，弃上清，加入 0.2 mL 15%甘油，-80℃可长期保存。

三、实验方法 

3.1 载体构建

将待验证基因 X 的 CDS 构建到 pYES2 载体中，即为实验组 pYES2-X。

pYES2 载体克隆检测引物：

T7：TAATACGACTCACTATAGGG

CYC1 Terminator: GTGACATAACTAATTACATGATG

3.2 酵母转化

1. 取 100 μL R5421 感受态细胞于冰上融化，依次加入预冷的目的质粒 100 ng-1 μg，Carrier DNA(95-100℃，5 min，快速冰浴，重复一次)10 μL，PEG/LiAc 500 μL 并吸打几次混匀。

2. 30℃水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。

3. 42℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。

4. 10,000 rpm 离心 30 s 弃上清。

5. 加入 500 μL ddH2O 重悬，吸取 100 μL 涂布 SD/-Ura with Agar (含 100 mM KCl)固体培养基。28-30℃培养 2-3 d。

注：R5421 感受态细胞涂布 SD/-Ura 培养基也能生长，在添加 100 mM KCl 的平板上酵母菌生长速率会更快。

按表 2，将各质粒分别转化酵母 R5421 感受态细胞。

3.3 阳性克隆鉴定(选做)

此步骤可以忽略，详细步骤可参考 SK2420 酵母阳性克隆快速检测试剂盒进行，鉴定引物可以用 T7、 CYC1 Terminator，实际扩增条带为 155 bp + 目的片段大小。

3.4 钾离子转运活性检测

1. 在每个平板中挑取新鲜单菌落，用 SGR/-Ura Broth (含半乳糖/棉子糖/100 mM KCl)液体培养基过夜培养,OD600 为 1-2 之间。

2. 6000 g 离心 1 min，弃上清。用灭菌 ddH2O 洗涤 3 次，并用 ddH2O 稀释至 OD600 为 1。

3. 用 ddH2O 依次稀释 10 倍，100 倍，1000 倍 (即 OD600=1，0.1，0.01，0.001)。

4. 按照先后顺序，分别取 7 μL 点板于不同钾离子浓度(0 mM、1 mM、5 mM、10 mM、100 mM)的 APG/- Ura 平板。

5. 28-30℃培养 2-5 d，观察每个样品在不同筛选平板生的生长状况，从而确定目标蛋白是否具有钾离子转运活性。

酵母钾离子转运活性检测试剂盒

3.5 结果分析

将阴性对照载体 pYES2 和阳性对照载体 pYES2-AKT1 分别转化 R5421 感受态细胞。结果显示(图 1)，当培养基中 K⁺浓度为 100 mM 时，两种菌落均能够正常生长。当培养基中 K⁺浓度小于 100 mM 时，R5421 (pYES2-AKT1)菌株的生长明显强于 R5421 (pYES2)，说明 AKT1 的表达介导了酵母细胞的 K⁺转运吸收， 即 ATK1 具有 K⁺转运活性。