植物双荧光素酶报告基因检测试剂盒
植物双荧光素酶报告基因检测试剂盒
产品货号：HYYPB1034
报告基因检测是现代分子生物学研究领域中分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件（如启动子、增强子和沉默子等）和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具。
本试剂盒提供了一套简单高效、适用于检测植物启动子与转录因子互作关系的瞬时转化方法。采用了本公司独家研制的侵染缓冲液、广泛适用的表达载体、高灵敏反应底物和明星互作对照组，可以快速获得高质量的互作检测结果。
植物双荧光素酶报告基因检测试剂盒
储存条件：请按产品包装要求储存，有效期 1 年。
植物双荧光素酶报告基因检测试剂盒产品组分：
Component 产品货号 类型 规格 Store
5×农杆菌侵染液 HYYPB1011 溶液 80mL 4℃
乙酰丁香酮(100 mM) HYYPB1026 溶液 400μL -20℃，避光
双荧光素梅报告基因检测试剂盒 HYYPB1276 试剂盒 50T 按说明书
D-荧光素钾盐 HYYPB1038 粉末 100mg -20℃，
pGreenII 0800-Luc hyypb5240 空载质粒 10μL 质粒 -20℃
pGreenII 62-SK hyypb5239 空载质粒 10μL 质粒 -20℃
pGreenII 0800-p53-Luc hyypb5679 对照质粒 10μL 质粒 -20℃
pGreenII 62-SK-53AD hyypb5680 对照质粒 10μL 质粒 -20℃
GV3101(pSoup-p19) Chemically Competent Cell hyypb1056 感受态 100μL×10 支 -80℃
吸附柱 50 支
产品介绍：
报告基因检测是现代分子生物学研究领域中分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件（如启动子、增强子和沉默子等）和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具。
本试剂盒提供了一套简单高效、适用于检测植物启动子与转录因子互作关系的瞬时转化方法。采用了本公司独家研制的侵染缓冲液、广泛适用的表达载体、高灵敏反应底物和明星互作对照组，可以快速获得高质量的互作检测结果。
产品特点：
1.本产品将荧光素酶报告基因实验用到的载体及试剂组合起来并提供了试验全流程方案，帮助研究人员方便、快捷的完成实验。
2.酶的浓度线性范围可达 7 个数量级。
注意事项：
1.本产品提供了荧光素酶报告基因实验的方案，具体操作可根据自己试验的实际情况对相关内容进行调整。
2.本产品不提供的感受态及其它试剂可以在本司单独购买。
3.虽然本产品操作步骤以烟草为例，但实际可尝试应用于更多荧光素酶报告基因受体植物。
4.质粒建议重新转化大肠杆菌扩繁，提取质粒后使用。
植物双荧光素酶报告基因检测试剂盒
操作步骤：（在开始操作前请先阅读注意事项）
（一）载体构建
将所研究的启动子序列构建到 pGreenII 0800-Luc 载体 MCS 区（卡那抗性）；将所研究的目标蛋白的 CDS 序列构建到 pGreenII 62-SK 载体 MCS 区（卡那抗性）。
（二） 转化（以转化烟草为例）
1.转化农杆菌：将构建好的 2 个实验组质粒、1 个空载质粒（pGreenII 62-SK）及阳性对照分别转化农杆菌 GV3101（Psoup-p19）感受态，涂布在含有 50 μg/mL Kan 的 YEB 平板上。28℃培养约 2 天即可长出单菌落。
2.摇菌：从上一步得到的平板上挑取直径约 1-2 mm 农杆菌单菌落到 5 mL 的 YEB 液体培养基中（含有50μg/mL Kan 和 25μg/mL Rif）。过夜培养 14-18 h，使用分光光度计测定菌液的 OD 值，一般情况下，OD值不超过 1 即可（一般在 0.6-1.0 之间）。
注 1：实际操作时可根据后续试验组合需要，扩大或缩小摇菌体积。
注 2：加入利福平的目的是防止杂菌生长，实际操作中可以选择不添加。添加利福平会造成农杆菌生长速度减慢，利福平添加量一般为 25 μg/mL。对于不具有利福平抗性的菌株，则需根据各菌株的对应抗性，选择相应抗生素进行培养。
3.配制 Activation Buffer：在无菌条件下，用无菌双蒸水将农杆菌侵染液稀释为 1×工作液，然后取 4 mL的工作液加入 4 μL（1/1000）体积的 100 mM 乙酰丁香酮混匀备用。
注：Activation Buffer 需要现配现用，根据第 3 步菌液的体积配置合适体积的 Activation Buffer。
4.混菌，收集菌体：实验一般设置四个组合，在 2 mL 无菌离心管中按照 1:1 体积混合两种菌液，保证最终 1 mL 的重悬菌液的 OD600 不超过 1。4000 g 离心 10 min 收集菌体，弃去上清。
5.重悬菌体：第 3 步收集到的菌体每管用 1 mL 的 Activation Buffer 重悬，室温静置 2-3 h。
6.注射法侵染烟草叶片：
使用 1 mL 无菌注射器吸取上一步得到的重悬液，避开烟草叶脉，确认要注射的区域，先用注射器针头在要注射的区域中间轻微划一下，造成“微创”，注意不要划破叶片；左手抵在叶片的正面，右手将注射器（不带针头）垂直压在烟草的背面，右手拇指慢慢推压注射器，观察转化液在表皮下扩散到一定范围。每次试验建议将 2 种处理组合注射到同一片叶子上。同一株烟草至少选取 3 个叶片进行注射。同一批试验建议至少注射 3 株烟草。
注：最好选择生长到 4-5 片叶子时期的烟草，单个组合 1 mL 菌液即可满足 9 块区域的注射要求，如注射范围较大，需额外多配制菌液。
（二）结果观察
荧光素酶成像
- 将注射暗培养 2-3 天的烟草植株取出，避光向叶片背面均匀喷洒稀释好的工作液，黑暗中静置 10 分钟.
- 2. LB985 NightSHADE 植物分子影像系统观察结果
注 1：用无菌水配置 200×的 D-荧光素钾盐储备液（30mg/mL），PCR 管分装 200μL 每管，于-80℃避光保存或直接使用。
注 2：用预热好的完全培养基 1:200 稀释 D-荧光素钾盐储备液，配制 150μg/mL 工作液。
荧光素酶酶活
1.将注射的叶片分区域剪碎至液氮中，充分研磨成粉末状后分区少部分于新的 1.5 mL 离心管内；
2.向离心管内加入 0.5-1.0mL 新配置的裂解液，振荡混匀使叶片粗蛋白充分裂解，在冰上裂解 10 分钟；
注 1：在 1mL 的冷裂解液中各加入 10μL 的蛋白酶抑制剂和 10μL 的 PMFS；混匀，放置在冰上备用。
注 2：实验过程中，所有试剂都需要预冷或者即融，实验过程中保证低温操作。
3.将充分裂解后的粗蛋白置于吸附柱中，4℃ 12000rpm 离心 1min，收集过滤后的液体于新的 1.5mL EP管内备用；
4.酶活检测：
(1) 按照仪器说明书要求将荧光检测打开，设定参数，测定时间为 10 s，测定间隔为 2 s；
(2) 将样品按照 20～100 μL 的体积加入测量管中（保持每次样品的加样量一致），另外加入 100 μL 萤火虫荧光素酶检测试剂Ι混匀 2-3 次（不能漩涡混匀），充分混匀后测定 RLU（Relative light unit）；
(3) 将检测后的样品，加入 100 μL 配制的 Renilla Luciferase Assay 工作液混匀 2-3 次，充分混匀后测定RLU；
(4) 将(2)检测的 RLU 值与(3)检测出的 RLU 值进行比较，通过得出的比值来确定报告基因的激活程度。
注：Renilla Luciferase Assay 工作液需现配先用，不能反复冻融。
Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：
按照样品要求的量，将海参荧光素酶检测底物（100×）按照稀释比例加入海参荧光素酶检测 buffer，混匀后室温放置。（海参荧光素酶底物试剂体积较小，收到后请先离心后使用。应置于冰浴。开盖使用后及时关闭瓶盖，防止挥发，放置-80℃。
温度会对酶的活性产生影响，因此除海参荧光素酶检测底物（100×）以外的其它试剂应放置室温后再使用。
