双荧光素梅报告基因检测试剂盒

双荧光素梅报告基因检测试剂盒

Double-Luciferase Reporter Assay Kit

HYYPB1276-50T

储存条件：试剂盒于-20℃保存。CellLysis Buffer-20℃保存一年，配制好的荧光素酶反应试剂(LuciferaseReaction Reagent 和 Luciferase Reaction ReagentII)需分装后避光保存，-70℃可保存一年，-20℃可保存一个月。

双荧光素梅报告基因检测试剂盒

产品说明：

萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾萤光素酶(Renilla luciferase)可分别催化荧光素(luciferin)或腔肠素(coclenterazine)氧化形成 oxyluciferin 或 coelenteramide，并在此过程中产生生物荧光。TransDetect*Double-Luciferase Reporter Assay Kit 首先以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶报告基因的活性，之后在淬灭该荧光反应的同时，以腔肠素为底物检测海肾荧光素酶报告基因的活性，具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广、无细胞内源活性干扰等特点。

产品组成：

                               HYYPB1276-50T          HYYPB1276-200T

Luciferase Reaction Buffer               5 ml                      20ml

Luciferase Reaction Substrate (Lyophilized)  1 vial                      4 vial

Luciferase Reaction Buffer II              5 ml                      20 ml

Luciferase Reaction Substrate II(50×)       100μl                 400μl

Cell Lysis Buffer (5×)                    5 ml                     20 ml

双荧光素梅报告基因检测试剂盒

操作步骤：

1、试剂配制

将 Luciferase Reaction Buffer 与 Luciferase Reaction Buffer II 从-20℃取出，恢复至室温，保证各组分完全溶解。

注意：Luciferase Reaction Buffer II 如出现沉淀属正常现象，充分震荡溶解后即可使用。

(1) Luciferase Reaction Reagent用 Luciferase Reaction Buffer 充 分 溶 解 冻 干 状 态 的 Luciferase Reaction Substrate (5 ml Buffer +1VialSubstrate)，分装后-20℃或-70℃避光保存，避免反复冻融。

(2) Luciferase Reaction Reagent II

按 1:49 的比例将 Luciferase Reaction SubstrateII 同 Luciferase Reaction Buffer II 混合，分装后-20℃或-70℃避光保存，避免反复冻融。

(3) 1×Cell Lysis Buffer

按 1:4 的比例将 5×Cell Lysis Buffer 同 Nuclease-free Water 混合备用。

2、样品处理

a.动物细胞

(1)贴壁细胞: 去除细胞培养基，用 1×PBS 小心润洗两次，加入适量 1×Cell Lysis Buffer，室温充分裂解10 分钟后，刮取细胞于 1.5ml 离心管中。

悬浮细胞: 收集细胞，300×g 离心 5 分钟，去除培养基。加入适量 1×Cell Lysis Buffer，吹打混匀，室温充分裂解 10 分钟。

Cell Culture Plate         Lysis Buffer/Well

6-well                    500μl          

12-well                   250 μl

24-well                   100 μl

48-well                   60μl

96-well                20μl

(2)裂解完成后，2-8℃，12,000×g 离心 10 分钟，取上清待检测。

b.植物叶片(以烟草叶盘为例)

(1)取 3-4 片直径为 6-8mm 的烟草叶盘放入 2ml 的 EP 管中，同时加入预冷的 3-4 个小钢珠，并加入适量的液氮，使用破碎仪进行研磨破碎;或取 3-4 片直径为 6-8mm 的烟草叶盘放入研钵中，加入适量液氮，用研磨杵研磨破碎。

(2)破碎完成后，成粉末状，加入 300μl 1×Cell Lysis Buffer(1 个叶盘对应 100μl 裂解液)。吹打混匀，室温充分裂解 5 分钟。

(3)2-8℃，12,000×g 离心 2 分钟，取上清待检测。

c.原生质体

(1)收集原生质体，计数，300×g 离心 5 分钟，去除上清。

(2)按照 105 原生质体/100μl I×Cell Lysis Buffer 加入裂解液，吹打混匀，室温充分裂解 10 分钟。

(3)2-8℃，12,000×g 离心 2 分钟，取上清待检测。

3、荧光检测

将 100μl 平衡至室温的 Luciferase Reaction Reagent 加入 1.5ml 离心管或者不透明 96 孔板中，再小心吸取 20μl 裂解物至反应管或板中，水平震荡混匀，于化学发光仪(luminometer)中检测萤火虫荧光素酶报告基因的活性。之后吸取 100μl 平衡至室温的 Luciferase Reaction ReagentII 加入上述反应管或板中，水平震荡混匀，于化学发光仪中检测海肾荧光素酶报告基因的活性。

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注意事项：

1. Luciferase Reaction Buffer II 在溶解过程中可能有部分沉淀析出，使用前应充分震荡或将其置于 37℃水浴锅中，保证其完全溶解后再使用。

2. Lucifcrase Reaction Reagent 和 Luciferase Reaction ReagentII 反应前需平衡至室温。

3. 为保证实验数据准确可靠，建议测量大量样品时使用排枪添加 Luciferase Reaction Reagent 和 Luciferase

ReactionReagent II，使用过程中务必留意排枪各孔吸取的液体是否一致。

4. Lucifcrase Rcaction Reagent 和 Luciferase Reaction ReagentII 均易发生氧化反应，请合理安排实验，避免样品解冻后在室温下长时间放置。