Y1HGold单杂互作验证试剂盒

 

           Y1HGold单杂互作验证试剂盒

 

产品组成：

 

培养基：     SD-ura with  agar     0.5L

        SD-ura BROTH        0.5L

        YPDA 培养基         0.5L

        SD-leu with  agar     0.5L

        SD-leu  broth       0.5L

 

筛选试剂   金担子素                1ml，1mg/ml

鉴定试剂盒  酵母菌株PCR试剂            1ml

转化试剂盒  酵母感受态制备与转化试剂盒   20T

  

对照菌株    Y1hgold（P53-ABai）菌株              200ul

        Y1hgold（p53-abai+PGADt7-P53）菌株          200ul

 

感受态细胞   Y1hgold感受态细胞                 20*100ul          

 

 

注： 

1. 本试剂盒可用于10对单杂互作验证（质粒除外）。

2. 注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80℃保存。

3. 0.5L×2 表示：2 个包装，每个包装0.5L；5×1mL 表示：1个包装，含5个1mL。

4. 对照菌株的最佳 AbA 浓度参考网站菌株说明书。

 

产品说明：

Y1HGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统使用的菌株Y1HGold 是 MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。

筛选标记住为: ura3，leu2；报告基因为：AbAr。

Y1HGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统需要 pAbAi 和 pGADT7 两种质粒配套使用。质粒 pAbAi 的筛选标志为URA，用于表达 pBait-AbAi construct (1~3个 bait DNA序列重复串联后克隆到pAbAi 中)；质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768~881 位氨基酸)与目标蛋白（Prey）的融合蛋白。GAL4-AbA 酵母单杂系统原理：Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度(0.1-0.2 μg/mL)下即可对酵母产生毒性。基因组中整合了 pBait-AbAi 的酵母菌株（Bait-Reporter Yeast Strains），当猎物蛋白（Prey）结合到诱饵序列（Bait DNA）上，GAL4 AD 就会激活 AbAr 的表达，从而能够在含有抗生素 AbA 的培养基上生长。AbAr 与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可以降低酵母单杂假阳性发生的概率。

本方案中筛选诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度和互作验证都采用了稀释点板的方法，与涂板的方法相比，点板法能更直观的体现出 DNA 和蛋白的互作，还能减少培养基和 AbA 的使用量。本方案中诱饵菌株鉴定采用了高保真酶，大大减少了操作步骤，另外本方案还对常见的酵母单杂结果进行了分析。

 

 

一、实验耗材和试剂.

二、菌株使用与保存.

三、实验方法.

3.1 pBait-AbAi 转化 Y1HGold.

3.1.1 pBait-AbAi 质粒线性化.

3.1.2 pBait-AbAi 转化 Y1HGold.

3.1.3 诱饵菌株鉴定.

3.2 筛选诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度.

3.3 Y1HGold[pBait]感受态制备与 Prey 转化.

3.4 互作验证.四、 互作验证分析.

4.1 互作.

4.2 Prey 蛋白有毒性.

4.3 无互作.

五、 注意事项.

 

一、实验耗材和试剂

本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。

1. 灭菌的枪头（1000μL、200μL、10μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90mm 培养皿，备用。

2. Carrier DNA 在 95-100℃水浴 5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。

3 稀释金担子素：取 100μL AbA（1mg/mL）于 900μL 无水乙醇中稀释，充分混匀，即 AbA 浓度为100μg/mL， 4℃冰箱中备用（稀释10倍后使用，有利于在培养基中混匀，建议按用量稀释）。

4. 自备 0.9%生理盐水，可用 ddH2O 无菌水代替，备用。

5 普通平板制备：将 1 条培养基溶于 0.5 L 去离子水中，无需调节 pH 值，高压灭菌（如，115℃灭菌 20min）。液体培养基 4℃ 冰箱保存；固体培养基，20-25 mL/块倒平板（Φ90mm），凝固后 4℃冰箱保存。

6 特殊平板制备：SD/-Leu（AbA）或 SD/-Ura（AbA）：将一条 SD/-Leu with Agar 培养基溶于 500 mL 去离子水中，无需调节 pH 值，高压灭菌（如，115℃灭菌 20 min），冷却至 50℃左右，参照表 1 加入稀释后的金担子素（AbA）， 倒平板 20 mL/块（Φ90mm），凝固后于 4℃冰箱保存。

 

二、菌株使用与保存

1. 挑取一环甘油保存的菌液（10-50μL）于 SD 平板上划线，28-30℃培养3-5 d，培养出来的单菌落可直 接用于互作验证实验。

2. 挑取上述单菌落于 SD 液体培养基中，200 r/min、28-30℃振荡培养 2d，OD600应大于1，取 1mL 菌液集菌，弃上清，加入 0.2 mL 15%甘油，-80℃可长期保存。

注：Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7-p53]和 Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7]用 SD/-Leu 培养基， Y1HGold[p53-AbAi]用 SD/-Ura 培养基。 

 

三、实验方法 

Y1HGold 酵母杂交互作验证实验方案较多，本公司根据多年经验，给出一个较优方案，略过载体构建， 可为四个步骤：pBait-AbAi 转化 Y1Hgold，筛选诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度，Y1HGold[Bait]感受态制备与 Prey 转化，互作验证。此外，本方案还对常见的互作验证结果进行了分析。

 

3.1 pBait-AbAi 转化 Y1HGold

pAbAi 质粒是通过同源重组的方式整合到酵母染色体组中而存在于酵母体内的，所以转化之前要通过酶切的方法将环状的质粒线性化。将线性化的 pAbAi 质粒转入酵母 Y1HGold 菌株中，转化后的重组子（诱饵 AbA 特异性报告菌株）可以在 SD/-Ura 培养基上生长。

 

3.1.1 pBait-AbAi 质粒线性化

pBait-AbAi、p53-AbAi 和 Empty pAbAi 空载（或 Mutant Bait pAbAi）测序后，将其大肠杆菌菌液进行扩大培养，然后提取质粒。用 Bstb 限制性内切酶（NEB）进行线性化处理。

诱饵载体酶切体系

组分

BstBI      4-10ul

质粒DNA    4-10ug

10Xbuffer  20-50ul

无酶水     补充体系到200-500ul

 

65 ℃酶切 2 h，1%的琼脂糖跑胶，检测载体是否酶切完全，纯化回收。

 

3.1.2 pBait-AbAi 转化 Y1HGold

1. 取 100µL 冰上融化的 Y1HGold 感受态细胞（货号：CC308），依次加入预冷的线性化质粒 pAbAi（2-5µg）， Carrier DNA 10µL（95-100℃，5 min，快速冰浴，重复一次），PEG/LiAc 500 µL 并吸打几次混匀，30℃ 水浴 30min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。

2. 将管放 42℃水浴 15min (7.5min 时翻转 6-8 次混匀)。

3. 5000rpm 离心 40s 弃上清，ddH2O 400µL 重悬，离心 30s 弃上清。

4. ddH2O 50µL 重悬，涂板 SD-/Ura 平板，30℃培养 3-5d（同时，将 Y1HGold 阳阴性菌株于 SD 平板划 线活化）。

 

3.1.3 诱饵菌株鉴定

1. 准备 PCR 预混液：根据检测克隆数，等比例扩大配制体积。

 

2. 吸取 5μL 酵母快速裂解液加入 PCR 管中。

3. 用无菌牙签或 10μL 枪头刮取筛选出来 SD/-Ura 固体培养基上的单菌落（直径 1-2mm，刮取 1/4 即可） 悬浮在裂解液中。

4. 吹打或者震荡混匀后 PCR 仪 98 ℃裂解 5min，即为裂解产物。

5. 在裂解产物中加入 45μL PCR 预混液（含引物），PCR 扩增。PCR 反应条件：98℃ 3 min；98 ℃ 10s， 60℃ 30 s，72℃ 1 min（15-30s/kb）；72℃ 5 min。35 个循环。

6 将 PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶电泳并测序验证。

 

注： 

a. 本公司提供的酵母基因组菌落 PCR 试剂盒中 Y1HGold 引物混合物（未公开序列）扩增空载 pAbAi 重组 Y1HGold 的产物为 1346 bp。测序可以用 pAbAiF（GCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTC），或插入片段的特异性引物。

b. 用 1%的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 扩增产物，鉴定阳性克隆，消除假阳性（

PCR 分析结果应为：阳性对照. 1.4 kb；阴性对照. 无条带；诱饵菌株. 1.35 kb+insert size）。

 

3.2 筛选诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度

诱饵酵母菌株在没有 Prey 载体存在情况下，其基本 AbA 表达量非常低。对于不同的诱饵片段，其 AbA* 最佳使用浓度不同。因此，需要筛选每个诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度，具体步骤如下：

1. 上述的转化验证成功之后，每个样品挑取新鲜单菌落（2-3mm）于 1 mL 0.9% 氯化钠溶液中重悬，OD600 调至 0.2（也可以用 SD-Ura 液体培养基培养至 OD600=0.2）

2. 用 0.9%氯化钠溶液依次稀释 10 倍，100 倍，1000 倍（即 OD600=0.2，0.02，0.002，0.0002）。

3. 分别点板 10μL 于 SD/-Ura；SD/-Ura with AbA(100 ng/mL、200 ng/mL、

300 ng/mL、500 ng/mL、800 ng/mL、 1000 ng/mL)平板，如图 1 所示。

4. 30℃培养 2-3d，观察诱饵酵母在不同 AbA 浓度平板上生长状况，从而确定 AbA 最佳使用浓度（例如， Y1HGold[p53-AbAi]诱饵菌株 OD600=0.002 时，在 SD/-Ura with AbA(200 ng/mL）平板上刚好不能生长)。

注：在不同浓度 AbA 平板上（100 ng/mL，200 ng/mL，300 ng/mL，500 ng/mL，700 ng/mL，1000 ng/mL）， 出现的酵母菌斑最少或完全没有，即为 AbA 最佳使用浓度（最佳抑菌浓度、最小抑菌浓度、本底表达浓度、自激活浓度）。一般情况下 AbA 浓度不宜超过 1000ng/mL。

 

 

 

 

3.3 Y1HGold[pBait]感受态制备与 Prey 转化

1. 挑取鉴定成功的 Y1HGold[pBait-AbAi]单菌落于 SD-Ura 培养基平板上划线，30℃培养 3-5d。

2. 待酵母单菌落直径长至 2-3 mm，挑取单菌落接种到含有 3mL YPDA 液体培养基的 15mL 摇菌管中。 30℃，200rpm 过夜培养。

3. 将 3 mL 小摇菌体(上步小摇所得)接到含有 50mL 液体 YPDA 培养基的三角瓶中继续培养，待 OD600达到 0.4-0.5，3000rpm 离心 5min，弃上清。（

4 ℃保存 1 周内的酵母菌液，用 3mL 接种 5mL YPDA 培养基过夜培养）。

4. 用 10mL Y1 溶液重悬沉淀，3000rpm 离心 5min，弃上清。

5. 加入 1mL Y2 溶液重悬，50μL 分装于 1.5mL 无菌离心管，可直接用于转化或冷冻保存。

注：制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80 ℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盒中，先置于-80 ℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80 ℃冰箱，可保存一年。使用前室温融化后用于转化。

6. 取上述 Y1HGold[pBait-AbAi]感受态细胞 50µL 于冰上，依次加入预冷的目的质粒 2µg，Y3 溶液 350μL， 轻柔吸打混匀，30℃水浴 60min (10min 时翻转 1 次混匀)。对于部分菌种，延长孵育时间可提高转化效率， 但不要超过 3 h。建议用 ddH2O 补充体积，将质粒与 Y3 溶液的体积定容为 0.36mL。实验组和对照组的设置参考表 1。

表 1 Prey 转化诱饵菌株

注：对照组 1*可以更好的体现实验组是否互作。对照组 2**诱饵菌株可以是 Y1HGold[Mutant Bait pAbAi] 也可以是 Y1HGold[Empty pAbAi]，可以避免诱饵序列突变（或无诱饵）的情况下，猎物直接激活报告基 因而造成的假阳性，这种假阳性并不多见，可以省略。

7. 3000rpm 离心 5min，弃上清。

8. 用 0.5 mL YPD Plus Liquid Medium 重悬沉淀，30 ℃摇床震荡培养 30-60 min，12000 rpm 离心 15 s，弃 上清。

9. 加入 50µL ddH2O 重悬菌体，涂板 SD-/Leu 平板，30℃培养 3-5 d。

 

3.4 互作验证 

1. 上述的转化成功之后，每个样品挑取新鲜单菌落（2-3 mm）于 1mL 0.9%氯化钠溶液中重悬，OD600调至 0.2（也可以用 SD-Leu 液体培养基培养OD600=0.2）。

2. 再用 0.9%氯化钠溶液依次稀释 10 倍，100 倍，1000 倍（即 OD600=0.2，0.02，0.002，0.0002）。

3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点板 10μL 于相应的 SD/-Leu with AbA*平板，参考图 1。

4. 30℃培养 2-3 d，观察每组重组酵母在对应的自激活 AbA 浓度平板上生长状况，从而确定是否互作。

 

四、 互作验证分析

4.1 互作

由诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度筛选可知 Y1HGold[p53-AbAi]自激活浓度是 100ng/mL。由图 2 可知，在SD/-Leu平板上，对照组 Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7-p53]和 Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7]长势相同 。 在 SD/-Leu with AbA(100 ng/mL) 平 板 上 ， Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7-p53] 长 势明显优于 Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7]，所以 p53-AbAi 与 pGADT7-p53 具有互作。同理，Bait1 和 Prey1 也有互作。

注：GAL4 AD-p53 与 p53 结合序列（顺式作用元件）的相互作用而诱发 AbA 抗性基因 AUR1-C 的表达， 所以 Y1HGold[p53-AbAi+pGADT7-p53]能够在 SD/-Leu with AbA (1000ng/mL)平板上生长。

 

4.2 Prey 蛋白有毒性 

由诱饵酵母菌株的 AbA 最佳使用浓度筛选可知 Y1HGold[pBait2-AbAi]自激活浓度是 100ng/mL。由图2可知，在SD/-Leu平板上，Y1HGold[pBait2-AbAi+pGADT7-Prey2]长势弱于对照组Y1HGold[pBait2-AbAi+pGADT7]，可能是Prev蛋白有毒性导致;但是在 SD/-Leu with AbA(100ng/mL)和SD/-Leu with AbA (300ng/mL)平板上，Y1HGold[pBait2-AbAi+pGADT7-Prey2]长势优于Y1HGold[pBait2-AbAitpGADT7]，所以Bait2与prey2 有互作。

注:酵母杂交互作验证实验，不适于毒性很强的 Prey 蛋白。

 

4.3 无互作 

由图 2 可知，在所有的SD平板上， Y1HGold[pBait3-AbAi+pGADT7-Prey3]/Y1HGold[pBait3-AbAi+pGADT7 和

Y1HGold[pBait4-AbAi+pGADT7-Prey4]/Y1HGold[pBait4-AbAi+pGADT7]长势都相同，所以 Bait3 与 prey3,Bait4 与 prey4 均无互作。

注 ： Y1HGold[pBait3-AbAi+pGADT7] 仅 在 SD/-Leu 平板上生长 ，说明 Bait3 无自激活 。 Y1HGold[pBait5-AbAi+pGADT7]能够在 SD/-Leu with AbA (300ng/mL)平板上长势相同，说明 Bait5 具有一 定的自激活。

 

 

 

五、 注意事项

1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

3. 请注意无菌操作，避免微生物污染。