GV3101 (pJIC SA_Rep)感受态细胞
GV3101 (pJIC SA_Rep)感受态细胞
GV3101 (pJIC SA_Rep)Chemically Competent Cell
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编号 |
名称 |
规格 |
单位 |
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WR0621-101 |
GV3101 (pJIC SA_Rep)感受态细胞 |
10×100μl |
盒 |
GV3101 (pJIC SA_Rep)感受态细胞产品规格
存条件: -80℃
GV3101 (pJIC SA_Rep)感受态细胞基因型
C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline(pJIC SA_Rep -tetR)
GV3101 (pJIC SA_Rep)感受态细胞产品说明
GV3101(pJIC SA_Rep)菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性；在GV3101菌株中转入help质粒：pJIC SA_Rep即为GV3101(pJIC SA_Rep)菌株，可帮助pgR106，pgR107，pGreen，pGs2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tetR）抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。本公司生产的GV3101(pJIC SA_Rep)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pGs2质粒（4445bp，KanR）检测转化效率>103 cfu/μg DNA。
GV3101 (pJIC SA_Rep)感受态细胞操作方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA（转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3. 加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素（不含四环素抗性）的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天
（当平板只含有50 μg/ml kan 时，28℃培养48 h即可；平板中同时加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 时，需28℃培养60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h）。
GV3101 (pJIC SA_Rep)使用注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量，本公司生产的GV3101(pJIC SA_Rep)化学转化感受态细胞具有四环素抗性，但在转入目标质粒涂板筛选阳性克隆时，只需加入目标质粒抗性的抗生素，不加四环素。
3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。
备注
1.脓杆菌相关抗生素配方：
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备注抗生素 |
配方 |
原液 |
工作液 |
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羧苄青霉素(carb) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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硫酸卡那霉素(kan) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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壮观霉素(spec) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
75 μg/ml |
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链霉素(strep) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
50 μg/ml |
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利福平(rif) |
DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
60 mg/ml |
20 μg/ml |
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庆大霉素(gent) |
双蒸水溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
40 μg/ml |
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氯霉素（cam） |
无水乙醇溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌 |
100 mg/ml |
68 ug/ml |
2.常用脓杆菌抗性：（R：抗；S：敏感）
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农杆菌菌株 |
羧苄青霉素 (carb) |
链霉素 (strep) |
利福平 (rif) |
庆大霉素 (gent) |
硫酸卡那霉素 (kan) |
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AGL-1 |
R |
S |
R |
S |
S |
|
EHA101 |
S |
S |
R |
S |
R |
|
EHA105 |
S |
S |
R |
S |
S |
|
LBA4404 |
S |
R |
R |
S |
S |
|
GV3101 |
S |
S |
R |
R |
S |
3.LB和YEB配方：
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Component |
LB(液体)/L |
LB(固体)/L |
component |
YEB(液体)/L |
YEB(固体)/L |
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Tryptone |
10 g |
10 g |
Tryptone |
5 g |
5 g |
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Yeast extract |
5 g |
5 g |
Yeast extract |
1 g |
1 g |
|
NaCl |
10 g |
10 g |
牛肉浸膏 |
5 g |
5 g |
|
NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
蔗糖 |
5 g |
5 g |
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Agar |
－ |
15 g |
MgSO4*7H2O |
0.49 g |
0.49 g |
|
|
|
|
NaOH |
调PH到7.0 |
调PH到7.0 |
|
|
|
|
Agar |
－ |
15 g |
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