GUS报告基因定量检测试剂盒

                        GUS 报告基因定量检测试剂盒

GUS定量试剂盒产品储存:-20℃保存，一年有效。

GUS定量试剂盒  产品组成:

提取液        50 mL    100 mL

4-MU(1mM)    1 mL     1 mLx2

4-MUG 底物液 10 mL    10 mLx2

终止液        100 mLx2  100 mLx4

GUS定量试剂盒产品说明:

GUS 能与 4-MUG 反应产生荧光物质 4-MU。4-MU 的激发波长为 365 nm，发射波长为456nm。其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋自在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测 GUS 的含量。

荧光分光光度计测定的是相对值，因此用荧光分光光度计测定时必须用标准物 4-MU 进行校准。

GUS定量试剂盒使用方法:

一、植物总蛋白提取

1.取新鲜的植物组织 100 mg 左右，用液氮将材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。

如果无法立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80 ℃冰箱。

2.将研磨破碎的组织转到EP 管里，并竟即加入1mL的提取演，充分混匀。

3. 12 000 rpm，4 ℃离心 10 min。

4.将上清转至另一洁净的 EP 管，12,000 rpm，4℃离心 10 min.

5.所得上清即为蛋白提取物，可以置于冰上待用，或者-80 ℃保存。

二、蛋白浓度的测定(Bradford 法)

参照本公司产品 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒(华越洋右手)使用说明书。

三、标准溶液配制

用终止液稀释 4-MU，建议稀释至浓度 1-10uM，即为标准液(避光放置)。用于标准曲线绘制。

四、GUS 表达水平的定量测定

1.在3个1mL的离心管中分别加入 900 uL 的终止液，置于 37 ℃温浴。

2. 取 150 uL 蛋白提取物，加入 150 uL 4-MUG 底物液，37 ℃温浴，即为反应液。

3.分别在 10 min，20 min，30 min 时，从上述反应体系中，取100uL加入步骤1中温浴的900 uL终止液中，避光放置直至测量结束。

4.用标准液的荧光值校准反应液中生成的 4-MU 的荧光值。

5. 计算 GUS 的活性 MU/min/ug 总蛋白。

五、计算举例:

1.蛋白定量需要做一个标准曲线 Y=kx。  x可以设为蛋白浓度，Y为吸光值。然后测出来的样品吸光值为Y1，计算出 x1=xmg/mL=xμg/μL:

2.MU 定量需要做一个标准曲线 M=kn，x可以设为 4-MU 的浓度，M 为荧光值。然后测出来的荧光值为

Ml(Tl=10min)，M2(T2=20min)。计算出来nl=nlμM，n2=n2μM:

3.酶活定量是个动态变化。依据酶活定义，单位时间内水解底物生成产物的量 MU/min/ug:

4.酶活计算方法。其中 MU=(n2-nl)μmol/L=(n2-nl)nmol/μL: min=T2-Tl=10min :ug=100/(150+150)x150/1000Xxug/uL=1/20xug/uL

5.所测样品中 GUS 的活性=(n2-nl)nmol/ μL/10min/(1/20xμg/μL)=2(n2-n1)/x nmol/min/ug

6. 解释为每ug 总蛋白每 min 可以水解底物产生 2（n2-n1）/xnmol 的 4-MU。

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