EHA105+PSOUP感受态细胞

           

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EHA105+PSOUP感受态细胞100ul*20waryongGW637-100μl询价
EHA105+PSOUP感受态细胞100ul*10

waryongGW637-100μl

EHA105+PSOUP感受态细胞操作方法(采用冻融法):

1. -80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。

2. 100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA(转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3. 加入700 μl无抗生素的LBYEB液体培养基,于28℃振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LBYEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3

(当平板只含有50 μg/ml kan 时,28℃培养48 h即可;平板中同时加入50 μg/ml kan20 μg/ml rif 时,需28℃培养60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h)。

 

EHA105+PSOUP感受态细胞注意事项:
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化 效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量,本公司生产的GV3101(pSoup)化学转化感受态细胞具有四环素抗性,但在转入目标质粒涂板筛选阳性克隆时,只需加入目标质粒抗性的抗生素,不加四环素。

3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。

4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。

5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)


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