酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒


 

编号

产品名称

HAG592

酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒

酵母高纯度质粒小量快速提取试剂盒

v 试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成

保存

100

平衡液

室温

2*5ml

RNaseA10mg/ml

-20℃

2*150 µl

Lytic Enzyme

-20℃

2*2.5 ml

溶液YP1

4℃

2*15 ml

溶液YP2

室温

2*15 ml

溶液YP3

室温

2*20 ml

去蛋白液PE

室温

2*16ml      

第一次使用前按说明加指定量乙醇

漂洗液WB

室温

2*15 ml

第一次使用前按说明加指定量乙醇

洗脱缓冲液EB

室温

2*15 ml

吸附柱EC

室温

2*50

收集管(2ml

室温

2*50

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1.        第一次使用时,将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1(终浓度100µg/ml)置于4℃保存。如果溶液YP1RNase A失活,提取的质粒可能会有微量RNA残留,在溶液YP1中补加RNase A即可。

2.        环境温度低时溶液YP2SDS可能会析出浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。

3.     Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液,因此比较粘稠,请小心取用,20℃保存。 蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶,它含有纤维素酶,果胶酶,淀粉酶,蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。

4.          避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

v  产品介绍:

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合lytic Enzyme特异消化酵母细胞壁,能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞,离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除, 最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

v  关于平衡液的使用

1.          介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37使沉淀完全消失。

2.          使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

v  注意事项

1.          所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.          溶液YP3和去蛋白液PE中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。

3.          通常酵母质粒拷贝数都很低,一般通过电泳或者分光光度计都很难检测到。提取的质粒如果用于下游试验时通常建议使用量为: 1-5μl用做PCR 模板;5-10μl 用于转化大肠杆菌,选择商业化的高效率的感受态细胞。

4.          用户需要自备Sorbitol buffer( 1M 山梨醇, 0.1M Na2EDTA28 mMβ-巯基乙醇)配制方法:600 ml 去离子水里面溶解 182.2山梨醇,加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ,不需要调节PH值,定容到1L4℃保存。临用前加0.2%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)

5.          菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x107 cells/ml,由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大,以上仅供参考

6.          洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保pH大于7.5 pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl 1mM EDTApH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

v  操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)

提示:

ð 第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!

ð RNase A全部加入溶液YP1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。

ð 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.2%β-巯基乙醇,回复到室温备用。

1.          1.5-5毫升酵母培养物(不超过5X107 cells)9,000rpm离心30秒,尽可能的吸弃上清,收集菌体。

收集超过1.5毫升菌液,可以离心弃上清后,在同一个1.5ml管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。

2.          加入300μl Sorbitol buffer,轻柔吹打充分重悬细胞;再加入50μl Lytic Enzyme储液,充分颠倒混匀,37温育1-3小时消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。

如果破壁效果不好导致质粒产量低,可以加大lytic Enzyme 用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间或者提高温度到45来提高效果,不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打 ,反复冻融等。玻璃珠法:向菌体中加入250μl溶液YP1(请先检查是否已加入RNase A)重悬沉淀,彻底悬浮菌体,加入0.1g直径为0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠,涡旋振荡10分钟,静置几分钟让玻璃珠沉淀,小心吸取上清到一个新管后接后续步骤4

3.          13,000rpm离心1分钟,尽可能吸弃上清,加入250μl溶液YP1重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。  

如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。

4.          250μl的溶液YP2,温和地上下翻转4 -7次使菌体充分裂解,室温放置4分钟。

温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。

5.          350μl溶液YP3,立即温和地上下翻转4 -7次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟,小心取上清。

加入溶液YP3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。

平衡液预处理吸附柱:

使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见前文“关于平衡液的使用”

6.          将上一步所得上清加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中), 12,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。

7.          加入500μl去蛋白液PE(请先检查是否已加入无水乙醇!12,000rpm 离心30-60秒,弃废液。

8.          加入600μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!12,000rpm 离心30-60秒,弃掉废液。

9.          加入600μl漂洗液WB12,000rpm 离心30-60秒,弃掉废液。

10.       将吸附柱EC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应

11.       取出吸附柱EC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位50-100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟,13,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。

洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于50μl,体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。

 

 

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