动物组织/细胞RNA提取试剂盒


产品货号

产品名称

北京华越洋生物GT2654

动物组织/细胞RNA提取试剂盒


动物组织/细胞RNA提取试剂盒产品简介:

       本试剂盒将高效的异硫氰酸胍裂解技术与硅基质膜纯化技术相结合,可从动物细胞及组织中高效提取总RNA。起始样本一般最多30 mg组织或1×107细胞。本试剂盒还可回收未完全纯化的RNA、体外转录和酶促反应后得到的RNA。用本试剂盒可提取纯化分子量大于200碱基的高品质RNA,几乎无DNA残留。如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验,残留的DNA可利用无RNaseDNase在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于RT-PCRNothern BlotDot Blot等下游实验。

 

动物组织/细胞RNA提取试剂盒产品构成:


Component

50 preps


DNase I

1000 U


10×Reaction Buffer

1000 μl


Buffer RL

35 ml


Buffer RW1

30 ml


Buffer RW2concentrate

11 ml


RNase-Free Water

10 ml


Spin Columns RMwith Collection Tubes

50


RNase-Free Centrifuge Tubes1.5 ml

50

自备试剂:β-巯基乙醇、无水乙醇(新开封或提取RNA专用)。

 

动物组织/细胞RNA提取试剂盒实验前准备及重要注意事项:

    1预防RNase污染,应注意以下几方面:

1)使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。

2)配制溶液应使用无RNase的水。

3)操作人员戴一次性口罩和手套,实验过程中要勤换手套。

    2.提取的样品避免反复冻融,否则影响RNA提取的量和质量。

    3.Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇,1ml Buffer RL加10μl β-巯基乙醇。加入β-巯

基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。

    4.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。

    5.Buffer RL如果产生沉淀,可于56℃加热使其溶解后室温放置。

    6.所有离心步骤均在室温下进行,且所有操作步骤动作要迅速。

 

动物组织/细胞RNA提取试剂盒操作步骤:

1. 样品处理

1.1组织:将组织在液氮中磨碎。每20-30 mg组织加600 μl Buffer RL(使用前检查是否加入β-巯基乙醇),组织样本少于20 mg加350 μl Buffer RL。样品体积不超过Buffer RL体积的1/10。

1.2单层培养细胞:将细胞在培养瓶中直接裂解或处理成细胞悬液,离心得到细胞沉淀,弃上清,每6-10 cm2培养面积加入600 μl Buffer RL,小于6 cm2加入350 μl Buffer RL,反复吹打几次,使其充分裂解。

1.3 细胞悬液:12,000 rpm(~13,400×g)离心1分钟弃上清,得到细胞沉淀。每5×106-1×107细胞加入600 μl Buffer RL,少于5×106细胞加入350 μl Buffer RL,反复吹打几次,使其充分裂解。注意:

1)尽量除尽细胞培养基,细胞培养基可能抑制细胞的裂解影响RNA产量。

 

2)尽量使细胞充分悬浮并充分裂解,否则影响RNA产量。

     2.样品充分裂解后,室温放置5分钟,使蛋白核酸复合物完全分离。

     3.12,000 rpm离心2-5分钟,取上清进行以下操作。

     4.向步骤3中得到的溶液中加入1倍体积(600 μl或350 μl)的70%乙醇(无RNase水配

制),混匀。

 

注意:加入乙醇后可能会产生沉淀,不会影响后续实验。

 

5.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中,若一次不能将全部溶液加入吸附柱中,请分两次转入,12,000 rpm离心1分钟,弃废液。将吸附柱放回收集管中。

 

注意:吸附柱的最大载量为100 µg,不要超载,否则会影响RNA的产量和纯度。

 

6.向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1,12,000 rpm离心1分钟,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。

 

7.配制DNase I 混合液:取52 μl RNase-Free Water,向其中加入8 μl 10×ReactionBuffer和20 μl DNase I(1 U/μl),混匀, 配制成终体积为80 μl的反应液。

8.向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液,20-30℃孵育15分钟。

     9.向吸附柱中加入200 μl Buffer RW1,12,000 rpm离心1分钟,弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。

    10.向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇), 12,000 rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。

    11.重复步骤10。

    12.12,000 rpm离心2分钟,倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。

注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

    13.将吸附柱转入新的离心管中,向吸附膜中间位置加入30-50 μl RNase-Free Water,室温放置1分钟,12,000 rpm离心1分钟,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。

注意:

    1)RNase-Free Wate体积不应小于30 μl,体积过小影响回收率。

2)如果要提高RNA的产量,可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤13。

3)如果要提高RNA浓度,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,重复步骤13。



 

 

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