GST标记蛋白质微量纯化试剂盒


产品货号

产品名称

北京华越洋生GT172

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒


GST标记蛋白质微量纯化试剂盒产品简介:

重组蛋白N 端的GST 谷胱甘肽S 转移酶(Glutathione S Transferase)能提高重组蛋白的水溶性,所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用 GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合,并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立,是目前分离纯化 GST 标记蛋白质的重要方法。


GST标记蛋白质微量纯化试剂盒产品规格:

规格

成分

20T

保存条件

谷胱甘肽-Agarose   介质,50%

4 ml

4

10×PBS   缓冲液

100 ml

RT

GST   洗脱缓冲液成分一

25 ml

RT

GST   洗脱缓冲液成分二

80   mg

4

溶菌酶(20   KU/mg

30 mg

-20

Benzonase2U/ul

20 ul

-20

PMSF10   mg/ml

0.5 ml

RT

6   mL 层析柱(带筛板)

1

RT

 

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒运输及保存:

低温运输。收到货后按照以上说明存放各组分,有效期12个月。

 

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒使用方法:

注意:

1.    每步得到的样品最好都留存少量作为 SDS-PAGE 分析的对照,在下面描述中就不再提醒。

2.    本实验需要用到的 1×PBS 缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供10×PBS 缓冲液而得。PBS 缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌,注意防止污染。

3.    GST 洗脱液的配制方法是将约 80mg GST 洗脱液成分二干粉全部加入到 GST 洗脱液成分一溶液中,摇晃直到干粉全部溶解即得 GST 洗脱液,分装成小份放-20℃保存,每次用一管。

 

:重组蛋白的表达和细菌收集

1.    37振荡培养 20 mL含表达质粒的细菌到 OD600=0.6-0.8

2.    IPTG 到终浓度为 0.1 mM30振荡培养 3 小时或 22振荡培养 8 小时(或过夜)。

3.    4 5000 g 离心 10 分钟收集 20 mL表达菌液,弃上清。

4.    1×PBS 缓冲液重悬细菌沉淀,4 5000 g 离心 10 分钟,弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80保存。

 

二:细胞裂解

5.    如果用本产品 A 型,用 1 mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液(1 mL 1× PBS 缓冲液+50 uL溶液 A+ 25 uL 10 mg/mL PMSF 溶液)重悬细菌沉淀,冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索,一般选 1K-10K 频率处理 15 次,每次 20 秒,间隔 1 分钟(必需放置在冰上)。裂解物不能粘稠,否则会堵塞层析柱。

6.    如果用本产品 B 型,在 1 mL 冰浴的新鲜配制的细胞裂解液(在 20 mL 1×PBS 缓冲液中加入所有 30 mg 溶菌酶干粉,溶解后分装成 1 mL/管,取一管使用,剩余的-20放置)中加入 25 uL 10 mg/mL PMSF 溶液和 1 uLBenzonase,用此混合液重悬细菌沉淀后冰上放置 30 分钟,得到细菌裂解物。

7.    将超声或酶法细胞裂解物在13000 g 4离心10 分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱,所得上清即含可溶性 GST 标记蛋白。

 

三:层析柱的制备和 GST 蛋白纯化

8.    摇晃将谷胱甘肽-Agarose 介质充分混匀后,取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中(介质用量需要根据 GST 蛋白产量决定,100 mL 菌液一般使用 200 uL介质即可)。下列步骤各溶液的用量均针对 200 uL介质而定,如果介质用量不同,各溶液用量需相应调整。

9.    5 mL 预冷的 1×PBS 缓冲液洗柱。

10. 7 步得到的上清液(含可溶性 GST 标记蛋白)上柱,让重力使上柱液自然流出,收集并保存穿透液用于 SDS-PAGE 电泳。GST 和谷胱甘肽之间的结合很缓慢,所以流速一定不能快,否则结合不充分。流速一般在 0.2-1 mL/分钟即可。如要提高 GST 标记蛋白与介质的结合效率,可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上,让细菌裂解液和介质在4结合 30 分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。

11.  0.5-2 mL 1×PBS 缓冲液洗柱,收集并保存穿透液(含杂蛋白)。

12.  0.2-1 mL GST 洗脱液洗柱,收集并保存穿透液(含 GST 标记蛋白)。由于可能含蛋白酶污染,所以穿透液不能在 4放置,需立即用于后续处理(如浓度测定或 SDS-PAGE 电泳)或-80长期放置。

13.  对收集的 2 种穿透液和洗脱液进行蛋白定量或 SDS-PAGE 分析。注意:如果不预先脱盐,则只能用 Bradford 法或 OD 检测法(1 OD280 约等于 0.5 mg/mL 蛋白)测定穿透液和洗脱液的蛋白浓度。由于 GST 的分子量为 26 KD,所以在 SDS-PAGE 胶上,GST 标记蛋白将比天然蛋白大 26 KD

 

附:GST 柱的恢复(本试剂盒不含所需试剂)

1.    3 倍体积的 6 M 盐酸胍处理柱子 10 分钟。

2.    3 倍体积的超纯水处理柱子 10 分钟。

3.    3 倍体积的缓冲液一(0.5 M NaCl0.1 M TrisHClpH 8.5)处理柱子 10 分钟。

4.    3 倍体积的缓冲液二(0.5 M NaCl0.1 M TrisHClpH 4.5)处理柱子 10 分钟。

5.    再重复 3-4 步两次。

6.    3 倍体积的超纯水处理柱子 3 次。

7.    3 倍体积的 1×PBS 缓冲液处理柱子 2 次。

8. 堵上漏口,加 3 倍体积的 1×PBS 缓冲液待用。若长时间不用,则第 7 步和第 8 步的 1×PBS 改成 20%的乙醇。


 

 

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